【摘要】：第一部分小分子二甲基硫醚對(duì)氧化應(yīng)激損傷的作用 目的：二甲基硫醚(dimethyl sulfide, DMS)是一種易揮發(fā)硫化物,也是大氣中最主要的含硫物質(zhì)。其在人類的血液、尿液、口氣甚至是皮膚組織中都存在,但有關(guān)于DMS在高等動(dòng)物中的功能卻鮮有報(bào)道。本部分旨在研究DMS在高等動(dòng)物體內(nèi)對(duì)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及對(duì)壽命的調(diào)控作用。 方法：頂空固相微量萃取法氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、活性氧熒光探針、超氧化物熒光測(cè)定、脂質(zhì)過氧化物測(cè)定、細(xì)胞存活率測(cè)定、電子自旋波譜測(cè)定和模式動(dòng)物壽命實(shí)驗(yàn) 結(jié)果：(1)DMS在大鼠的多個(gè)重要組織中均存在,線蟲、果蠅等體內(nèi)也存在DMS,其含量低于大鼠組織；在衰老大鼠的腦和心臟組織中DMS含量顯著下降；(2)在大鼠腦組織勻漿和心臟組織勻漿中,生理濃度的DMS(1μM)顯著降低過氧化氫誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化程度,其標(biāo)記物丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量顯著下降；(3)生理濃度的DMS (0.2μM,1μM和5μM)顯著抑制PC12細(xì)胞中抗霉素A(antimycinA, AA)誘導(dǎo)的活性氧簇生成；(4)DMS (5μM)顯著抑制AA誘導(dǎo)的超氧化物生成；使用電子自旋波譜技術(shù)測(cè)定AA誘導(dǎo)的羥基自由基,發(fā)現(xiàn)DMS (5μM)顯著降低AA誘導(dǎo)的羥基自由基生成；(5)培養(yǎng)基中加入DMS能夠延長(zhǎng)線蟲和果蠅的壽命；含10μM DMS的培養(yǎng)基組,線蟲由衰老引起的超氧化物蓄積顯著降低：以100μM DMS處理能降低果蠅由衰老引起的脂質(zhì)過氧化物堆積。 結(jié)論：DMS是存在于高等動(dòng)物組織中的一種內(nèi)源性抗氧化物,具有減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和延長(zhǎng)動(dòng)物壽命的作用,可能在內(nèi)源性抗氧化防御體系中扮演了重要角色。 第二部分小分子二甲基硫醚抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制 目的：蛋氨酸亞砜還原酶A (methionine sulfoxide reductase, MsrA)是蛋氨酸亞砜還原酶家族的重要成員之一,由于其在體內(nèi)氧化還原過程中的作用受到了廣泛關(guān)注。MsrA廣泛表達(dá)于從低等到高等的大多數(shù)物種的各種組織中,可以修復(fù)發(fā)生氧化損傷的蛋白,對(duì)包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細(xì)胞具保護(hù)作用。近年來有研究表明MsrA不僅可修復(fù)蛋白質(zhì)損傷,還可直接增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)活性氧的清除,減緩細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn),L-蛋氨酸可能是MsrA發(fā)揮抗氧化作用的重要底物。目前,尚無報(bào)道發(fā)現(xiàn)其他內(nèi)源性小分子作為底物參與MsrA催化的抗氧化體系。本部分從MsrA催化抗氧化體系的化學(xué)生物學(xué)機(jī)制出發(fā),探討內(nèi)源性DMS發(fā)揮抗氧化作用的分子機(jī)制。 方法：魯米諾化學(xué)發(fā)光、電子自旋共振波譜、腺病毒表達(dá)-shRNA表達(dá)干擾、構(gòu)建蛋白表達(dá)質(zhì)粒、表達(dá)純化融合蛋白、Western Blotting免疫印跡、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、熒光各向異性測(cè)定、計(jì)算機(jī)構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)模型、計(jì)算機(jī)模擬蛋白-底物相互作用、定點(diǎn)突變、頂空固相微量萃取法氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 結(jié)果：(1)體外實(shí)驗(yàn)表明：DMS本身具有抗氧化性,高濃度時(shí)(1mM和10mM)能劑量依賴性地減少試管反應(yīng)中的過氧化氫含量,但低濃度DMS (0.1mM)的抗氧化作用較弱：在Fenton反應(yīng)體系中,高濃度的DMS (1mM)能直接減少羥基自由基的含量,但低濃度DMS (0.1mM)不能降低體系中羥基自由基；(2)體外實(shí)驗(yàn)表明：MsrA可直接催化低濃度的DMS和過氧化氫、羥基自由基等發(fā)生反應(yīng),在MsrA催化下,0.1mM DMS清除過氧化氫和羥基自由基的能力顯著增強(qiáng)；(3)使用慢病毒介導(dǎo)的小發(fā)卡RNA (small harpin RNA, shRNA)技術(shù)下調(diào)PC12細(xì)胞中MsrA的表達(dá),能取消DMS的抗氧化應(yīng)激、保護(hù)細(xì)胞的作用。和對(duì)照shRNA病毒組相比,對(duì)照病毒組中的DMS能顯著降低AA誘導(dǎo)的超氧化物熒光,而MsrA shRNA病毒組中,DMS不能降低超氧化物的熒光值。對(duì)照病毒組中,DMS能顯著降低過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡；MsrA shRNA病毒組,DMS不能降低MDA水平;(4)DMS對(duì)果蠅壽命的延長(zhǎng)作用依賴于果蠅的MsrA,使用UAS-GAL4系統(tǒng)抑制果蠅MsrA的轉(zhuǎn)錄后,DMS延長(zhǎng)果蠅壽命的作用被取消；(5)熒光各向異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,DMS與MsrA可發(fā)生直接的相互作用；氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MsrA會(huì)把DMS轉(zhuǎn)化成二甲基亞砜(DMSO);通過生物信息學(xué)和計(jì)算化學(xué)建立MsrA的空間結(jié)構(gòu)模型,分析MsrA催化抗氧化的化學(xué)生物學(xué)機(jī)制,模擬各種小分子底物和MsrA的結(jié)合方式,證明DMS是MsrA的優(yōu)勢(shì)底物,并推測(cè)出介導(dǎo)催化反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)包括：72位半胱氨酸殘基,103位酪氨酸,115谷氨酸殘基,即C72,Y103,E115；(6)定點(diǎn)突變催化反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基后,MsrA對(duì)活性氧的催化反應(yīng)活性明顯下降。 結(jié)論：內(nèi)源性DMS是MsrA催化抗氧化體系的重要小分子底物,在氧化應(yīng)激條件下,通過和MsrA的72位半胱氨酸殘基,103位酪氨酸,115谷氨酸殘基等關(guān)鍵殘基形成中間體,快速和活性氧反應(yīng)生成DMSO,從而發(fā)揮其抗氧化作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3411

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本文編號(hào)：2443938