【摘要】：目的構(gòu)建靶向人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(COL1A1)分子的shRNA真核表達(dá)載體并檢測(cè)其對(duì)靶分子的干擾效應(yīng)。方法根據(jù)靶分子COL1A1基因序列,設(shè)計(jì)、合成編碼其shRNA的互補(bǔ)寡核苷酸序列,克隆至線性化的pSilencerTM2.1-U6 neo載體中并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析及測(cè)序鑒定;脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,經(jīng)G418篩選獲穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,RT-PCR及Western blot法檢測(cè)其對(duì)靶分子COL1A1表達(dá)的影響。結(jié)果酶切及DNA測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒pshRNA-COL1A1序列正確。與對(duì)照組比較,重組表達(dá)質(zhì)粒pshRNA-COL1A1-1和pshRNA-COL1A1-2在mRNA和蛋白水平均能顯著抑制COL1A1基因的表達(dá)(P0.05),抑制率分別為(44.41%±3.90%,63.05%±3.13%)及(45.50%±2.71%,66.98%±2.08%)。結(jié)論成功構(gòu)建靶向人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞COL1A1基因的shRNA真核表達(dá)載體。
[Abstract]:Aim to construct the eukaryotic expression vector of shRNA targeting human type I collagen 偽 1 chain (COL1A1) and detect its interference effect on the target molecule. Methods according to the target molecule COL1A1 gene sequence, the complementary oligonucleotide sequence encoding the shRNA was synthesized and cloned into the linearized pSilencerTM2.1-U6 neo vector. The recombinant plasmid was identified by restriction enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transfected into breast cancer cell line MDA-MB-231 by lipofectamine, and the stable expression cell line was screened by G418. The effect of the recombinant plasmid on the expression of target molecule COL1A1 was detected by RT-PCR and Western blot. Results restriction endonuclease digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant plasmid pshRNA-COL1A1 was correct. Compared with the control group, the recombinant expression plasmids pshRNA-COL1A1-1 and pshRNA-COL1A1-2 could significantly inhibit the expression of COL1A1 gene at the mRNA and protein levels (P0.05), and the inhibition rates were (44.41% 鹵3.90%), respectively. (63.05% 鹵3.13%) and (45.50% 鹵2.71%, 66.98% 鹵2.08%). Conclusion Eukaryotic expression vector shRNA targeting COL1A1 gene in human breast cancer MDA-MB-231 cells was successfully constructed.
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所;華南基因組中心;
【基金】：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2012203) 廣東省領(lǐng)軍人才專項(xiàng)基金(C1030925)
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2431403