【摘要】：近年來(lái),腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及冠心病,腦中風(fēng),動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥紊亂、退行性病變等疾病嚴(yán)重危害了人類(lèi)的健康,如何預(yù)防與治療這些疾病是一直亟待解決的健康問(wèn)題。而在這些疾病的發(fā)病與治療機(jī)制中,血管新生發(fā)揮重要作用。由組織中既存的成熟血管的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖和游走,逐漸分化重構(gòu)形成新的小血管的過(guò)程,叫做血管新生(angiogenesis)。在正常情況下血管新生僅發(fā)生在胚胎發(fā)育期,創(chuàng)傷愈合期等。而病理?xiàng)l件下會(huì)出現(xiàn)異常的血管新生,過(guò)度的血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)尤為明顯,而不足的血管生成會(huì)引起多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生,冠心病,腦中風(fēng),動(dòng)脈粥樣硬化等。血管新生是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程,包括:(1)內(nèi)皮細(xì)胞激活,細(xì)胞器增多,在表面出現(xiàn)突起;(2)內(nèi)皮細(xì)胞在促血管生成因子的刺激下產(chǎn)生蛋白酶,降解膜基質(zhì);(3)炎性細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞出芽、遷移;(4)促有絲分裂原刺激DNA合成及內(nèi)皮細(xì)胞增殖;(5)內(nèi)皮細(xì)胞分化,細(xì)胞間連接、管腔重建,外膜細(xì)胞沿新的血管內(nèi)皮向外遷移、分化、貼附,形成新的小血管。因此對(duì)血管新生的研究可以為血管生成相關(guān)疾病帶來(lái)新的治療方法。對(duì)于血管新生的調(diào)控,生長(zhǎng)因子及其受體家族公認(rèn)的占有重要地位,根據(jù)生長(zhǎng)因子及其受體的作用對(duì)研究血管生成的新型藥物和創(chuàng)新有效的治療手段一直是熱點(diǎn)。VEGF是目前公認(rèn)的作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子,其中VEGFA所介導(dǎo)的各信號(hào)級(jí)聯(lián)參與血管新生各個(gè)過(guò)程,直接控制血管新生的發(fā)生發(fā)展,在一定程度上決定了血管生成的結(jié)果。而VEGF的受體中主要在血管生成發(fā)揮重要作用的是VEGFR2,VEGFR2屬于受體酪氨酸激酶家族,在胞膜外大約含750個(gè)氨基酸殘基,由7個(gè)與Ig G相似的結(jié)構(gòu)域組成,與配體結(jié)合的部位主要在第三個(gè)Ig G結(jié)構(gòu)域,一個(gè)跨膜區(qū)、一個(gè)胞內(nèi)近膜區(qū)以及其位于胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū),其被一個(gè)由70個(gè)氨基酸構(gòu)成的激酶分開(kāi),最末端是C端。VEGFR2的活化需要在配體刺激下,單體構(gòu)象發(fā)生改變形成二聚體才能發(fā)生磷酸化,VEGFR2有多個(gè)磷酸化位點(diǎn),活性二聚體形成后相應(yīng)磷酸化位點(diǎn)發(fā)生活化。文獻(xiàn)報(bào)道VEGF與VEGFR2結(jié)合后可通過(guò)其下游PLCγ/ERK1/2、PI3K-AKT信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。同時(shí)二者結(jié)合后,還可以激活Src激酶信號(hào)通路,增加內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和滲透性。在血管新生整個(gè)過(guò)程中VEGF可連系多重信號(hào)通路,具有最直接有效的調(diào)控作用。對(duì)于血管新生的調(diào)節(jié)不僅可以從生長(zhǎng)因子及其受體活化、基質(zhì)降解、細(xì)胞出芽、遷移過(guò)程等入手。另一方面,在血管生成過(guò)程中的主導(dǎo)角色內(nèi)皮細(xì)胞的存活狀態(tài)同樣十分重要,血管生成主要依賴(lài)位于血管內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞接受一系列促血管生成因子信號(hào)的刺激,發(fā)生遷移、融合、形成小管等過(guò)程而形成,維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)保護(hù)其凋亡可以減弱血管受到外界環(huán)境凋亡誘導(dǎo)因子的破壞壓力,進(jìn)而保護(hù)血管的完整性,促進(jìn)血管生成。促進(jìn)病變組織器官血管新生是心血管系統(tǒng)疾病一種有效的治療手段,因此深入探討VEGF依賴(lài)血管生成機(jī)制和內(nèi)皮細(xì)胞存活狀態(tài)對(duì)血管生成類(lèi)疾病具有重要意義,有利于血管生成新藥的研發(fā)與臨床治療。在心血管系統(tǒng),血管內(nèi)皮細(xì)胞是凋亡誘導(dǎo)因子TNF-α作用的重要靶標(biāo),TNF-α協(xié)同蛋白質(zhì)合成抑制劑放線(xiàn)菌酮CHX,可使原來(lái)對(duì)TNF-α細(xì)胞毒作用不敏感的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,或者使對(duì)TNF-α敏感的細(xì)胞出現(xiàn)更強(qiáng)的凋亡效應(yīng)。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道,p53可轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外TNF-α誘導(dǎo)的死亡受體通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53蛋白最早是以抑癌蛋白被發(fā)現(xiàn),隨后相繼發(fā)現(xiàn)了p53蛋白的其他功能。其中最突出的特點(diǎn)是它是一種轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)可被誘導(dǎo)表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的停滯階段,繼而凋亡或者衰老。對(duì)于p53的活化,傳統(tǒng)的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為分為三步,分別為p53的穩(wěn)定化、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活化。對(duì)于p53的穩(wěn)定化主要是p53的翻譯后修飾,如乙酰化、甲基化、泛素化及磷酸化等。近年來(lái)也有發(fā)現(xiàn)由Mdm2和Mdm X介導(dǎo)的p53從抑制到釋放也是p53生理活化的關(guān)鍵步驟。Endophilin最初是在篩選小鼠胚胎細(xì)胞c DNA文庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)富含Src同源3結(jié)構(gòu)域(Src homology3,SH3)的蛋白質(zhì)。因早期研究發(fā)現(xiàn)該類(lèi)蛋白可通過(guò)其C末端的SH3結(jié)構(gòu)域與Amphiphysin,synaptojanin,dynamin等內(nèi)吞蛋白的多聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域結(jié)合,參與調(diào)控突觸囊泡的內(nèi)吞(endocytosis),因次被命名為Endophilin。Endophilin蛋白在結(jié)構(gòu)上均由三部分組成,即N-端的N-BAR結(jié)構(gòu)域、C端的SH3結(jié)構(gòu)域和連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)的中間可變鉸鏈區(qū)。C段的SH3結(jié)構(gòu)域則主要通過(guò)與其它蛋白的多聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域(proline-rich domains,PRD)結(jié)合發(fā)揮功能,而N-BAR結(jié)構(gòu)域在Endophilin二聚化及與膜的結(jié)合,進(jìn)而改變膜的曲率方面發(fā)揮重要作用;現(xiàn)今研究認(rèn)為,Endophilin包括Endophilin A和Endophilin B兩個(gè)亞類(lèi)。其中Endophilin A亞家族包括Endophilin A1,Endophilin A2和Endophilin A3三個(gè)成員;Endophilin B含Endophilin B1和Endophilin B2兩個(gè)成員。并且已有研究顯示,Endophilin B1和Endophilin B2主要參與調(diào)控線(xiàn)粒體的功能和細(xì)胞的凋亡;Endophilin A1主要特異性分布在腦組織,尤其在神經(jīng)突觸,Endophilin A3主要在腦和睪丸組織表達(dá);而Endophilin A2則廣泛分布與各種組織。我們實(shí)驗(yàn)室近期的研究結(jié)果表明,在血管平滑肌細(xì)胞中Endophilin A1和Endophilin A3無(wú)表達(dá),而Endophilin A2卻高表達(dá)。并且Endophilin A2是調(diào)控Cl C-3膜轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵分子,在調(diào)控Cl C-3氯通道活性中發(fā)揮重要作用。同時(shí)在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn),在高血壓過(guò)程中,血管平滑肌Endophilin A2表達(dá)上調(diào),下調(diào)Endophilin A2表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡;在內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),Endophilin A2是e NOS內(nèi)源性穩(wěn)定分子,其通過(guò)PRD結(jié)構(gòu)域與e NOS結(jié)合,進(jìn)而抑制E3泛素連接酶Itch誘導(dǎo)的e NOS降解。上調(diào)Endophilin A2可對(duì)抗高血壓、高脂和高糖等誘導(dǎo)的e NOS表達(dá)下調(diào),NO生成減少以及內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能障礙。并且Endophilin A2可作為整合素β1的內(nèi)源性抑制分子調(diào)控血栓形成和內(nèi)皮細(xì)胞活化,上調(diào)Endophilin A2可抑制血栓的形成。盡管我們已往的工作已初步揭示了Endophilin A2是調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡,改善內(nèi)皮舒張功能障礙和調(diào)控血栓的重要因素,但其在心血管系統(tǒng)中血管新生的功能還遠(yuǎn)未被揭示�？紤]到血管生成在心血管多種疾病形成過(guò)程中的重要作用,本課題在明確了Endophilin A家族不同亞型在心血管系統(tǒng)各細(xì)胞表達(dá)特征的基礎(chǔ)上,研究了后肢缺血模型小鼠中Endophilin A2的表達(dá)變化及其對(duì)血管新生的作用,并進(jìn)一步從VEGFR2受體活化和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的角度探討了Endophilin A2調(diào)控血管新生的分子機(jī)制。第一部分Endophilin A2促進(jìn)后肢缺血模型小鼠血管新生及VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管新生采用Endophilin A2基因敲除小鼠和內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)基因小鼠,分別建立小鼠后肢缺血模型,應(yīng)用免疫印跡、免疫熒光、免疫組化、PCR等研究方法,探討了Endophilin A2對(duì)于血管生成的體內(nèi)作用。同時(shí)建立VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型,檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力及管腔形成能力,進(jìn)一步驗(yàn)證Endophilin A2對(duì)于血管生成的體外作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1.在WT小鼠后肢缺血模型實(shí)驗(yàn)中,在觀(guān)測(cè)時(shí)間內(nèi)(1-14天),缺血側(cè)肢(ischemic組)血流灌注隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。手術(shù)后1天Endophilin A2的表達(dá)在缺血側(cè)肢組(ischemic組)和側(cè)肢對(duì)照組(con組)相比無(wú)明顯變化。3天、7天、14天,ischemic組Endophilin A2的表達(dá)顯著高于con組,分別為2.33±0.20和1.06±0.01,4.37±0.57和0.91±0.17,6.13±0.45和1.51±0.4(p0.05,n=4)。同時(shí)隨著血流灌注的增加,Endophilin A2的表達(dá)逐漸增加,二者呈明顯的正相關(guān)。2.進(jìn)一步對(duì)后肢缺血模型小鼠21天時(shí)Endophilin A2的表達(dá)情況分析,Western blot方法顯示21天時(shí)ischemic組Endophilin A2的表達(dá)為2.72±0.28與con組0.84±0.23相比顯著增高(p0.01,n=8)。同時(shí)檢測(cè)血管生成過(guò)程中VEGFR2的表達(dá),Western blot方法顯示ischemic組VEGFR2的表達(dá)為3.74±0.94與con組1.02±0.11相比顯著增高(p0.05,n=4)。進(jìn)一步免疫熒光方法驗(yàn)證,在腓腸肌的組織切片中,顯微鏡下觀(guān)察ischemic組Endophilin A2陽(yáng)性紅色熒光染色高于con組。3.Endophilin A2敲除小鼠鑒定:敲除小鼠鑒定:PCR結(jié)果顯示,根據(jù)第一對(duì)引物出現(xiàn)1157bp的為野生型(Endo+/+),出現(xiàn)601bp條帶的為雜合子(Endo+/-)或者敲除型基因;第二對(duì)引物出現(xiàn)516bp條帶為野生型或者雜合子,若無(wú)則為敲除型基因(Endo-/-)。同時(shí),western blot結(jié)果顯示,在主動(dòng)脈組織中敲除小鼠組未見(jiàn)Endophilin A2表達(dá)。同時(shí)western blot結(jié)果顯示Endophilin A2基因敲除并不影響腦組織中Endophilin A1和Endophilin A3的蛋白表達(dá)水平。4.取Endophilin A2 KO小鼠進(jìn)行后肢缺血模型實(shí)驗(yàn),激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)手術(shù)后1天,3天,7天,14天,21天小鼠雙側(cè)下肢血流灌注情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Endophilin A2敲除小鼠在7天,14天,21天的血流灌注值顯著低于野生型小鼠(p0.05,n=6)。5.Western blot法結(jié)果顯示,在進(jìn)行后肢缺血手術(shù)后WT小鼠ischemic組CD31表達(dá)量高于con組,Endophilin A2 KO小鼠con組與WT小鼠con組CD31表達(dá)量無(wú)明顯差異,而Endophilin A2 KO小鼠ischemic組CD31表達(dá)量顯著低于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。同時(shí)免疫組化方法驗(yàn)證,顯微鏡下觀(guān)察Endophilin A2 KO小鼠ischemic組CD31陽(yáng)性染色顯著低于WT小鼠ischemic組。同時(shí)用免疫組化方法對(duì)平滑肌標(biāo)記物α-SMA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),在WT小鼠ischemic組α-SMA表達(dá)量高于con組,Endophilin A2 KO小鼠con組與WT小鼠con組α-SMA表達(dá)量無(wú)明顯差異,Endophilin A2 KO小鼠ischemic組α-SMA陽(yáng)性染色顯著低于WT小鼠ischemic組。6.Western blot法檢測(cè)VEGFR2水平,發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行后肢缺血手術(shù)后ischemic組VEGFR2表達(dá)量高于con組,Endophilin A2 KO小鼠con組與WT小鼠con組VEGFR2表達(dá)量無(wú)明顯變化,而Endophilin A2 KO小鼠ischemic組VEGFR2表達(dá)量顯著低于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。7.內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定及后肢缺血模型實(shí)驗(yàn):PCR結(jié)果顯示222bp大小的產(chǎn)物即為轉(zhuǎn)基因型小鼠;Western blot結(jié)果顯示,與WT組相比內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)基因小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中Endophilin A2蛋白表達(dá)明顯增加。取Endophilin A2內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行后肢缺血模型實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Endophilin A2內(nèi)皮特異性轉(zhuǎn)基因小鼠在7天,14天,21天的血流灌注值顯著高于野生型小鼠(p0.05,n=6)。8.Western blot法結(jié)果顯示,在進(jìn)行后肢缺血手術(shù)后在WT小鼠ischemic組CD31表達(dá)量高于con組,Endophilin A2 Tg小鼠con組與WT小鼠con組CD31表達(dá)量無(wú)明顯變化,而Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組CD31表達(dá)量顯著高于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。免疫組化方法驗(yàn)證,顯微鏡下觀(guān)察Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組CD31陽(yáng)性染色顯著高于WT小鼠ischemic組。顯微鏡下觀(guān)察Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組平滑肌標(biāo)記物α-SMA陽(yáng)性染色顯著高于WT小鼠ischemic組。9.Western blot法檢測(cè)VEGFR2表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),在WT小鼠ischemic組VEGFR2表達(dá)水平高于con組,Endophilin A2 Tg小鼠con組與WT小鼠con組VEGFR2表達(dá)量無(wú)明顯變化,而Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組VEGFR2表達(dá)量顯著高于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。10.在體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,沉默Endophilin A2的蛋白表達(dá),在VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移率與對(duì)照組相比顯著降低(p0.01,n=6);相反,過(guò)表達(dá)Endophilin A2,內(nèi)皮細(xì)胞的遷移率顯著升高(p0.05,n=6)。在VEGF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Tube formation實(shí)驗(yàn)中,沉默Endophilin A2的蛋白表達(dá),管腔形成數(shù)目顯著減少(p0.05,n=6),而過(guò)表達(dá)Endophilin A2,管腔形成數(shù)目明顯增多(p0.01,n=6)。小結(jié)1.小鼠后肢缺血模型中,缺血組織中Endophilin A2蛋白表達(dá)隨血流恢復(fù)而增加。2.敲除Endophilin A2抑制小鼠后肢缺血模型血流恢復(fù)速度,減少后肢血管CD31、α-SMA和VEGFR2的表達(dá)。3.內(nèi)皮特異性高表達(dá)Endophilin A2增加小鼠后肢缺血模型血流恢復(fù)速度,上調(diào)后肢血管CD31、α-SMA和VEGFR2的表達(dá)。4.Endophilin A2促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成。5.Endophilin A2是促進(jìn)血管新生,改善缺血部位血流恢復(fù)的關(guān)鍵分子。第二部分Endophilin A2促進(jìn)血管新生的VEGF信號(hào)通路分子機(jī)制研究結(jié)合前期工作基礎(chǔ),結(jié)合Endophilin A2小分子RNA干擾、腺病毒轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀、免疫印跡、免疫熒光、質(zhì)粒構(gòu)建等方法,探討了Endophilin A2在血管生成中對(duì)VEGF/VEGFR2的信號(hào)通路的作用及對(duì)VEGFR2的活化機(jī)制。1.Western blot法顯示,在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞沉默Endophilin A2對(duì)EGFR、Met、VEGFR2的蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性變化。同樣的過(guò)表達(dá)Endophilin A2亦不影響內(nèi)皮細(xì)胞中EGFR、Met、VEGFR2的表達(dá)(p0.05,n=6)。2.Western blot方法顯示,在VEGF 10ng/ml 5min誘導(dǎo)下,沉默Endophilin A2后,VEGFR2Tyr951、Tyr1059、Tyr1175位點(diǎn)磷酸化水平與相應(yīng)對(duì)照組相比顯著降低,(p0.05,n=6),而過(guò)表達(dá)Endophilin A2后,在VEGF10ng/ml 5min刺激下,VEGFR2Tyr951、Tyr1059、Tyr1175位點(diǎn)磷酸化水平與相應(yīng)對(duì)照組相比顯著升高(p0.05,n=6)。3.Western blot的結(jié)果中我們觀(guān)察到,沉默Endophilin A2的蛋白表達(dá)可以顯著減少VEGF誘導(dǎo)的p-PI3K、p-AKT、p-Src的表達(dá)(p0.05,n=6)。相反,過(guò)表達(dá)Endophilin A2,Endophilin A2過(guò)表達(dá)組中VEGF誘導(dǎo)的Src、PI3K、AKT磷酸化水平與對(duì)照組相比顯著升高(p0.05,n=6)。4.Western blot的結(jié)果中我們觀(guān)察到,沉默Endophilin A2的蛋白表達(dá),與對(duì)照組相比Endophilin A2干擾組中VEGF誘導(dǎo)的PLCγ、ERK、p38的磷酸化水平顯著降低(p0.05,n=6)。相反,過(guò)表達(dá)Endophilin A2,VEGF誘導(dǎo)的PLCγ、ERK、p38的磷酸化水平與對(duì)照組相比顯著升高(p0.05,n=6)。5.在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,免疫熒光結(jié)果顯示Endophilin A2與VEGFR2主要集中分布于胞漿和胞膜中,具有明顯的共定位。在共轉(zhuǎn)染Endophilin A2-RFP和VEGFR2-myc質(zhì)粒的COS7細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Endophilin A2與VEGFR2同樣具有明顯的共定位特性,提示Endophilin A2與VEGFR2很有可能存在相互作用。6.免疫共沉淀方法顯示,在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Endophilin A2和VEGFR2之間存在著相互結(jié)合。進(jìn)一步在外源性轉(zhuǎn)染Endophilin A2-Flag和VEGFR2-myc質(zhì)粒的COS7細(xì)胞株中,證實(shí)了Endophilin A2與VEGFR2間的相互結(jié)合作用。7.Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)SH3結(jié)構(gòu)域缺失后,Endophilin A2與VEGFR2相互作用依然存在,當(dāng)PRD結(jié)構(gòu)域缺失后,Endophilin A2與VEGFR2也依然存在相互作用,而當(dāng)N-BAR結(jié)構(gòu)域缺失后,二者相互作用消失,提示Endophilin A2是通過(guò)N-BAR結(jié)構(gòu)域與VEGFR2相互結(jié)合。8.Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VEGFR2和Endophilin A2(1-245aa)無(wú)相互作用,而與Endophilin A2(1-200aa)和Endophilin A2(1-175aa)存在結(jié)合,說(shuō)明VEGFR2和Endophilin A2的結(jié)合位置在其N(xiāo)-BAR結(jié)構(gòu)域200-245aa。9.免疫共沉淀方法顯示在VEGF 50ng/ml刺激15min下,Endophilin A2與VEGFR2的結(jié)合顯著增加。Con組和加VEGF組二者的結(jié)合率分別是0.74±0.17和1.71±0.4(p0.05,n=6)。10.在VEGF 50ng/ml刺激15min下,沉默Endophilin A2發(fā)現(xiàn),VEGFR2 dimer(460KDa)/VEGFR2 moner(230KDa)比值與對(duì)照組相比明顯減少。過(guò)表達(dá)Endophilin A2,VEGFR2 dimer(460KDa)/VEGFR2 moner(230KDa)比值與對(duì)照組相比明顯增多(p0.05,n=4)。11.內(nèi)皮細(xì)胞上免疫共沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn),VEGFR2與Src激酶在VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中存在相互結(jié)合,Endophilin A2通過(guò)SH3結(jié)構(gòu)域可以和Src發(fā)生結(jié)合,采用免疫共沉淀的方法,在沉默Endophilin A2后,VEGF刺激下,VEGFR2與Src的結(jié)合與對(duì)照組相比明顯減少(p0.05,n=6),同時(shí)過(guò)表達(dá)Endophilin A2后,VEGFR2與Src的相互作用與對(duì)照組相比明顯增多(p0.01,n=6)。在COS7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染VEGFR2-myc質(zhì)粒,同時(shí)分別轉(zhuǎn)染Endophilin A2(FL)-Flag全長(zhǎng)質(zhì)粒和Endophilin A2-△N-BAR-Flag質(zhì)粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染△N-BAR-Flag質(zhì)粒組VEGFR2與Src結(jié)合明顯少于轉(zhuǎn)染Endophilin A2(FL)-Flag全長(zhǎng)質(zhì)粒組(p0.05,n=6)。12.采用免疫共沉淀方法,發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞上,Endophilin A2與PLCγ存在相互結(jié)合。進(jìn)行免疫共沉淀定量檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在沉默Endophilin A2后,在VEGF刺激下,VEGFR2與PLCγ的結(jié)合與對(duì)照組相比明顯減少(p0.05,n=6),同時(shí)過(guò)表達(dá)Endophilin A2后,VEGFR2與PLCγ的相互作用與對(duì)照組相比明顯增多(p0.01,n=6)。小結(jié)1.Endophilin A2通過(guò)與VEGFR2結(jié)合,促進(jìn)VEGFR2二聚體的形成,進(jìn)而增加VEGFR2的自身磷酸化水平,促進(jìn)VEGFR2/PI3K/AKT,VEGFR2/Src以及VEGFR2/PLCγ/MAPK信號(hào)通路活化。2.VEGF作用增強(qiáng)Endophilin A2與VEGFR2結(jié)合,提示VEGFR2的磷酸化水平可能是調(diào)控兩者結(jié)合水平的重要因素。3.Endophilin A2通過(guò)其N(xiāo)-BAR結(jié)構(gòu)域的200-245個(gè)氨基酸序列與VEGFR2結(jié)合,而通過(guò)SH3結(jié)構(gòu)域與Src相互結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2/Src復(fù)合物形成,進(jìn)一步促進(jìn)Src信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。4.Endophilin A2與PLCγ存在相互作用,Endophilin A2通過(guò)促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2與PLCγ復(fù)合物形成,進(jìn)一步促進(jìn)VEGFR2/PLCγ/MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。第三部分Endophilin A2抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制建立CHX+TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡體外模型,應(yīng)用Endophilin A2敲除小鼠和小分子RNA干擾、腺病毒轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀、免疫印跡、免疫熒光、流式細(xì)胞技術(shù)、Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡等方法,探討Endophilin A2對(duì)CHX+TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。1.采用后肢缺血小鼠腓腸肌組織切片使用原位細(xì)胞凋亡試劑盒與Hochest共染,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Endophilin A2敲除小鼠缺血組中細(xì)胞凋亡紅色熒光數(shù)量明顯多于WT小鼠缺血組細(xì)胞凋亡紅色熒光數(shù)量。2.流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV APC/7AAD雙染法定量檢測(cè)凋亡率,CHX+TNF-αNegative組早期凋亡率為19.4±6.0,與Negative組相比,CHX+TNF-αEndophilin A2 Si RNA組早期凋亡率顯著升高至34.0±6.8(p0.01,n=6)。相反,CHX+TNF-αAd-Endo A2組早期凋亡率與CHX+TNF-αAd-GFP組相比顯著降低(p0.05,n=6)。3.Hochest染色顯示正常細(xì)胞核呈圓形或者橢圓形,顯示均勻的藍(lán)色熒光。給予CHX+TNF-α處理,引起核固縮,染色質(zhì)呈致密濃染的狀態(tài)及凋亡小體形成。沉默Endophilin A2后再給予處理CHX+TNF-α8h,與對(duì)照處理組相比,凋亡形態(tài)學(xué)改變加重,核固縮及凋亡小體增加(n=6)。而過(guò)表達(dá)Endophilin A2則會(huì)緩解CHX+TNF-α處理引起的凋亡形態(tài)學(xué)改變和凋亡小體形成(n=6)。4.Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),沉默Endophilin A2后,在CHX+TNF-α誘導(dǎo)下CD31的表達(dá)明顯少于對(duì)照組(p0.05,n=6),同時(shí)過(guò)表達(dá)Endophilin A2后,CD31的表達(dá)明顯多于對(duì)照組(p0.01,n=6)。5.在CHX+TNF-α誘導(dǎo)下,沉默Endophilin A2后,western blot結(jié)果顯示Caspase3總蛋白表達(dá)明顯減少,而其切割體cleaved Caspase3表達(dá)量明顯增多,cleaved Caspase3/Caspase3比值明顯增多(p0.05,n=6)。而過(guò)表達(dá)Endophilin A2后,結(jié)果顯示Caspase3總蛋白表達(dá)明顯增多,而其切割體cleaved Caspase3表達(dá)量明顯減少,cleaved Caspase3/Caspase3比值明顯減少(p0.01,n=6)。6.在CHX+TNF-α誘導(dǎo)下,沉默Endophilin A2后,結(jié)果顯示Caspase9總蛋白表達(dá)明顯減少,而其切割體cleaved Caspase9表達(dá)量明顯增多,cleaved Caspase9/caspase9比值明顯增多(p0.01,n=6)。而過(guò)表達(dá)Endophilin A2后,結(jié)果顯示Caspase9總蛋白表達(dá)明顯增多,而其切割體cleaved Caspase9表達(dá)量明顯減少,cleaved Caspase9/Caspase9比值明顯減少(p0.05,n=6)。7.在CHX+TNF-α誘導(dǎo)下,在沉默Endophilin A2后,結(jié)果顯示Bax蛋白表達(dá)明顯增多(p0.05,n=6)。而B(niǎo)cl-2的蛋白表達(dá)明顯減少(p0.05,n=6)。8.Western blot方法顯示,在CHX+TNF-α誘導(dǎo)下,沉默Endophilin A2后,結(jié)果顯示p53蛋白表達(dá)明顯增多(p0.05,n=6)。而過(guò)表達(dá)Endophilin A2后,結(jié)果顯示p53蛋白表達(dá)明顯增減少(p0.05,n=6)。9.采用免疫共沉淀的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Endophilin A2與p53存在相互作用。在外源性上,我們采用COS7細(xì)胞轉(zhuǎn)染Endophilin A2-Flag全長(zhǎng)質(zhì)粒,用p53去沉淀Endophilin A2外源性標(biāo)簽Flag,發(fā)現(xiàn)Endophilin A2與p53存在外源性結(jié)合。10.Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRD端缺失后,Endophilin A2與p53仍存在結(jié)合,而C端SH3缺失質(zhì)粒未見(jiàn)結(jié)合,因此Endophilin A2通過(guò)C端SH3結(jié)構(gòu)與p53結(jié)合。11.Western blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)EndophilinA2,p53的蛋白表達(dá)降低;預(yù)孵MG132后,Endophilin A2+MG132組p53蛋白表達(dá)與過(guò)Endophilin A2組相比顯著升高(p0.05,n=4)。小結(jié)1.敲除Endophilin A2增加后肢缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。2.Endophilin A2可抑制TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。3.Endophilin A2通過(guò)SH3結(jié)構(gòu)域與p53結(jié)合,調(diào)控p53表達(dá),進(jìn)而調(diào)控線(xiàn)粒體上p53相關(guān)靶蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá),抑制Caspse9-Caspase3信號(hào)通路,抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。4.Endophilin A2通過(guò)蛋白酶體通路降解作用調(diào)控p53的蛋白表達(dá)變化。結(jié)論1.Endophilin A2通過(guò)N-BAR結(jié)構(gòu)域的200-245個(gè)氨基酸位點(diǎn)與VEGFR2結(jié)合,促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2二聚體形成和受體自身磷酸化。2.Endophilin A2促進(jìn)VEGFR2/Src以及VEGFR2/PLCγ復(fù)合物形成,促進(jìn)VEGFR2/PI3K/AKT,VEGFR2/Src以及VEGFR2/PLCγ/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.Endophilin A2通過(guò)蛋白酶體通路降解作用下調(diào)p53表達(dá),穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜,抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。4.敲除Endophilin A2抑制血管新生,而內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)Endophilin A2則促進(jìn)血管新生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R363
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本文編號(hào)：2430919