【摘要】：近年來,腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及冠心病,腦中風,動脈粥樣硬化、炎癥紊亂、退行性病變等疾病嚴重危害了人類的健康,如何預防與治療這些疾病是一直亟待解決的健康問題。而在這些疾病的發(fā)病與治療機制中,血管新生發(fā)揮重要作用。由組織中既存的成熟血管的內皮細胞發(fā)生增殖和游走,逐漸分化重構形成新的小血管的過程,叫做血管新生(angiogenesis)。在正常情況下血管新生僅發(fā)生在胚胎發(fā)育期,創(chuàng)傷愈合期等。而病理條件下會出現異常的血管新生,過度的血管生成在腫瘤的生長過程中表現尤為明顯,而不足的血管生成會引起多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生,冠心病,腦中風,動脈粥樣硬化等。血管新生是一個多步驟的復雜過程,包括:(1)內皮細胞激活,細胞器增多,在表面出現突起;(2)內皮細胞在促血管生成因子的刺激下產生蛋白酶,降解膜基質;(3)炎性細胞產生趨化因子,誘導內皮細胞出芽、遷移;(4)促有絲分裂原刺激DNA合成及內皮細胞增殖;(5)內皮細胞分化,細胞間連接、管腔重建,外膜細胞沿新的血管內皮向外遷移、分化、貼附,形成新的小血管。因此對血管新生的研究可以為血管生成相關疾病帶來新的治療方法。對于血管新生的調控,生長因子及其受體家族公認的占有重要地位,根據生長因子及其受體的作用對研究血管生成的新型藥物和創(chuàng)新有效的治療手段一直是熱點。VEGF是目前公認的作用最強的血管生長因子,其中VEGFA所介導的各信號級聯(lián)參與血管新生各個過程,直接控制血管新生的發(fā)生發(fā)展,在一定程度上決定了血管生成的結果。而VEGF的受體中主要在血管生成發(fā)揮重要作用的是VEGFR2,VEGFR2屬于受體酪氨酸激酶家族,在胞膜外大約含750個氨基酸殘基,由7個與Ig G相似的結構域組成,與配體結合的部位主要在第三個Ig G結構域,一個跨膜區(qū)、一個胞內近膜區(qū)以及其位于胞內的酪氨酸激酶區(qū),其被一個由70個氨基酸構成的激酶分開,最末端是C端。VEGFR2的活化需要在配體刺激下,單體構象發(fā)生改變形成二聚體才能發(fā)生磷酸化,VEGFR2有多個磷酸化位點,活性二聚體形成后相應磷酸化位點發(fā)生活化。文獻報道VEGF與VEGFR2結合后可通過其下游PLCγ/ERK1/2、PI3K-AKT信號通路促進內皮細胞增殖和遷移。同時二者結合后,還可以激活Src激酶信號通路,增加內皮細胞的遷移和滲透性。在血管新生整個過程中VEGF可連系多重信號通路,具有最直接有效的調控作用。對于血管新生的調節(jié)不僅可以從生長因子及其受體活化、基質降解、細胞出芽、遷移過程等入手。另一方面,在血管生成過程中的主導角色內皮細胞的存活狀態(tài)同樣十分重要,血管生成主要依賴位于血管內層的內皮細胞接受一系列促血管生成因子信號的刺激,發(fā)生遷移、融合、形成小管等過程而形成,維持內皮細胞穩(wěn)態(tài)保護其凋亡可以減弱血管受到外界環(huán)境凋亡誘導因子的破壞壓力,進而保護血管的完整性,促進血管生成。促進病變組織器官血管新生是心血管系統(tǒng)疾病一種有效的治療手段,因此深入探討VEGF依賴血管生成機制和內皮細胞存活狀態(tài)對血管生成類疾病具有重要意義,有利于血管生成新藥的研發(fā)與臨床治療。在心血管系統(tǒng),血管內皮細胞是凋亡誘導因子TNF-α作用的重要靶標,TNF-α協(xié)同蛋白質合成抑制劑放線菌酮CHX,可使原來對TNF-α細胞毒作用不敏感的細胞出現凋亡,或者使對TNF-α敏感的細胞出現更強的凋亡效應。越來越多的文獻報道,p53可轉導細胞外TNF-α誘導的死亡受體通路介導細胞凋亡。p53蛋白最早是以抑癌蛋白被發(fā)現,隨后相繼發(fā)現了p53蛋白的其他功能。其中最突出的特點是它是一種轉錄因子,在細胞處于應激狀態(tài)時可被誘導表達,從而促進細胞進入細胞周期的停滯階段,繼而凋亡或者衰老。對于p53的活化,傳統(tǒng)的觀點認為分為三步,分別為p53的穩(wěn)定化、DNA結合、轉錄活化。對于p53的穩(wěn)定化主要是p53的翻譯后修飾,如乙�；�、甲基化、泛素化及磷酸化等。近年來也有發(fā)現由Mdm2和Mdm X介導的p53從抑制到釋放也是p53生理活化的關鍵步驟。Endophilin最初是在篩選小鼠胚胎細胞c DNA文庫時發(fā)現的一類富含Src同源3結構域(Src homology3,SH3)的蛋白質。因早期研究發(fā)現該類蛋白可通過其C末端的SH3結構域與Amphiphysin,synaptojanin,dynamin等內吞蛋白的多聚脯氨酸結構域結合,參與調控突觸囊泡的內吞(endocytosis),因次被命名為Endophilin。Endophilin蛋白在結構上均由三部分組成,即N-端的N-BAR結構域、C端的SH3結構域和連接這兩個結構的中間可變鉸鏈區(qū)。C段的SH3結構域則主要通過與其它蛋白的多聚脯氨酸結構域(proline-rich domains,PRD)結合發(fā)揮功能,而N-BAR結構域在Endophilin二聚化及與膜的結合,進而改變膜的曲率方面發(fā)揮重要作用;現今研究認為,Endophilin包括Endophilin A和Endophilin B兩個亞類。其中Endophilin A亞家族包括Endophilin A1,Endophilin A2和Endophilin A3三個成員;Endophilin B含Endophilin B1和Endophilin B2兩個成員。并且已有研究顯示,Endophilin B1和Endophilin B2主要參與調控線粒體的功能和細胞的凋亡;Endophilin A1主要特異性分布在腦組織,尤其在神經突觸,Endophilin A3主要在腦和睪丸組織表達;而Endophilin A2則廣泛分布與各種組織。我們實驗室近期的研究結果表明,在血管平滑肌細胞中Endophilin A1和Endophilin A3無表達,而Endophilin A2卻高表達。并且Endophilin A2是調控Cl C-3膜轉位的關鍵分子,在調控Cl C-3氯通道活性中發(fā)揮重要作用。同時在進一步的研究中發(fā)現,在高血壓過程中,血管平滑肌Endophilin A2表達上調,下調Endophilin A2表達抑制血管平滑肌細胞增殖,促進凋亡;在內皮細胞的研究中發(fā)現,Endophilin A2是e NOS內源性穩(wěn)定分子,其通過PRD結構域與e NOS結合,進而抑制E3泛素連接酶Itch誘導的e NOS降解。上調Endophilin A2可對抗高血壓、高脂和高糖等誘導的e NOS表達下調,NO生成減少以及內皮依賴性舒張功能障礙。并且Endophilin A2可作為整合素β1的內源性抑制分子調控血栓形成和內皮細胞活化,上調Endophilin A2可抑制血栓的形成。盡管我們已往的工作已初步揭示了Endophilin A2是調控血管平滑肌細胞增殖和凋亡,改善內皮舒張功能障礙和調控血栓的重要因素,但其在心血管系統(tǒng)中血管新生的功能還遠未被揭示。考慮到血管生成在心血管多種疾病形成過程中的重要作用,本課題在明確了Endophilin A家族不同亞型在心血管系統(tǒng)各細胞表達特征的基礎上,研究了后肢缺血模型小鼠中Endophilin A2的表達變化及其對血管新生的作用,并進一步從VEGFR2受體活化和內皮細胞凋亡的角度探討了Endophilin A2調控血管新生的分子機制。第一部分Endophilin A2促進后肢缺血模型小鼠血管新生及VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞血管新生采用Endophilin A2基因敲除小鼠和內皮特異性轉基因小鼠,分別建立小鼠后肢缺血模型,應用免疫印跡、免疫熒光、免疫組化、PCR等研究方法,探討了Endophilin A2對于血管生成的體內作用。同時建立VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞模型,檢測人臍靜脈內皮細胞的遷移能力及管腔形成能力,進一步驗證Endophilin A2對于血管生成的體外作用。結果發(fā)現:1.在WT小鼠后肢缺血模型實驗中,在觀測時間內(1-14天),缺血側肢(ischemic組)血流灌注隨著時間延長而逐漸增加。手術后1天Endophilin A2的表達在缺血側肢組(ischemic組)和側肢對照組(con組)相比無明顯變化。3天、7天、14天,ischemic組Endophilin A2的表達顯著高于con組,分別為2.33±0.20和1.06±0.01,4.37±0.57和0.91±0.17,6.13±0.45和1.51±0.4(p0.05,n=4)。同時隨著血流灌注的增加,Endophilin A2的表達逐漸增加,二者呈明顯的正相關。2.進一步對后肢缺血模型小鼠21天時Endophilin A2的表達情況分析,Western blot方法顯示21天時ischemic組Endophilin A2的表達為2.72±0.28與con組0.84±0.23相比顯著增高(p0.01,n=8)。同時檢測血管生成過程中VEGFR2的表達,Western blot方法顯示ischemic組VEGFR2的表達為3.74±0.94與con組1.02±0.11相比顯著增高(p0.05,n=4)。進一步免疫熒光方法驗證,在腓腸肌的組織切片中,顯微鏡下觀察ischemic組Endophilin A2陽性紅色熒光染色高于con組。3.Endophilin A2敲除小鼠鑒定:敲除小鼠鑒定:PCR結果顯示,根據第一對引物出現1157bp的為野生型(Endo+/+),出現601bp條帶的為雜合子(Endo+/-)或者敲除型基因;第二對引物出現516bp條帶為野生型或者雜合子,若無則為敲除型基因(Endo-/-)。同時,western blot結果顯示,在主動脈組織中敲除小鼠組未見Endophilin A2表達。同時western blot結果顯示Endophilin A2基因敲除并不影響腦組織中Endophilin A1和Endophilin A3的蛋白表達水平。4.取Endophilin A2 KO小鼠進行后肢缺血模型實驗,激光多普勒血流儀監(jiān)測手術后1天,3天,7天,14天,21天小鼠雙側下肢血流灌注情況。結果發(fā)現Endophilin A2敲除小鼠在7天,14天,21天的血流灌注值顯著低于野生型小鼠(p0.05,n=6)。5.Western blot法結果顯示,在進行后肢缺血手術后WT小鼠ischemic組CD31表達量高于con組,Endophilin A2 KO小鼠con組與WT小鼠con組CD31表達量無明顯差異,而Endophilin A2 KO小鼠ischemic組CD31表達量顯著低于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。同時免疫組化方法驗證,顯微鏡下觀察Endophilin A2 KO小鼠ischemic組CD31陽性染色顯著低于WT小鼠ischemic組。同時用免疫組化方法對平滑肌標記物α-SMA的表達進行檢測,在WT小鼠ischemic組α-SMA表達量高于con組,Endophilin A2 KO小鼠con組與WT小鼠con組α-SMA表達量無明顯差異,Endophilin A2 KO小鼠ischemic組α-SMA陽性染色顯著低于WT小鼠ischemic組。6.Western blot法檢測VEGFR2水平,發(fā)現在進行后肢缺血手術后ischemic組VEGFR2表達量高于con組,Endophilin A2 KO小鼠con組與WT小鼠con組VEGFR2表達量無明顯變化,而Endophilin A2 KO小鼠ischemic組VEGFR2表達量顯著低于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。7.內皮特異性轉基因小鼠鑒定及后肢缺血模型實驗:PCR結果顯示222bp大小的產物即為轉基因型小鼠;Western blot結果顯示,與WT組相比內皮特異性轉基因小鼠主動脈內皮細胞中Endophilin A2蛋白表達明顯增加。取Endophilin A2內皮特異性轉基因小鼠進行后肢缺血模型實驗,結果發(fā)現Endophilin A2內皮特異性轉基因小鼠在7天,14天,21天的血流灌注值顯著高于野生型小鼠(p0.05,n=6)。8.Western blot法結果顯示,在進行后肢缺血手術后在WT小鼠ischemic組CD31表達量高于con組,Endophilin A2 Tg小鼠con組與WT小鼠con組CD31表達量無明顯變化,而Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組CD31表達量顯著高于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。免疫組化方法驗證,顯微鏡下觀察Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組CD31陽性染色顯著高于WT小鼠ischemic組。顯微鏡下觀察Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組平滑肌標記物α-SMA陽性染色顯著高于WT小鼠ischemic組。9.Western blot法檢測VEGFR2表達水平發(fā)現,在WT小鼠ischemic組VEGFR2表達水平高于con組,Endophilin A2 Tg小鼠con組與WT小鼠con組VEGFR2表達量無明顯變化,而Endophilin A2 Tg小鼠ischemic組VEGFR2表達量顯著高于WT小鼠ischemic組(p0.05,n=6)。10.在體外細胞遷移實驗中,沉默Endophilin A2的蛋白表達,在VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞的遷移率與對照組相比顯著降低(p0.01,n=6);相反,過表達Endophilin A2,內皮細胞的遷移率顯著升高(p0.05,n=6)。在VEGF刺激的人臍靜脈內皮細胞Tube formation實驗中,沉默Endophilin A2的蛋白表達,管腔形成數目顯著減少(p0.05,n=6),而過表達Endophilin A2,管腔形成數目明顯增多(p0.01,n=6)。小結1.小鼠后肢缺血模型中,缺血組織中Endophilin A2蛋白表達隨血流恢復而增加。2.敲除Endophilin A2抑制小鼠后肢缺血模型血流恢復速度,減少后肢血管CD31、α-SMA和VEGFR2的表達。3.內皮特異性高表達Endophilin A2增加小鼠后肢缺血模型血流恢復速度,上調后肢血管CD31、α-SMA和VEGFR2的表達。4.Endophilin A2促進VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞的遷移和管腔形成。5.Endophilin A2是促進血管新生,改善缺血部位血流恢復的關鍵分子。第二部分Endophilin A2促進血管新生的VEGF信號通路分子機制研究結合前期工作基礎,結合Endophilin A2小分子RNA干擾、腺病毒轉染、免疫共沉淀、免疫印跡、免疫熒光、質粒構建等方法,探討了Endophilin A2在血管生成中對VEGF/VEGFR2的信號通路的作用及對VEGFR2的活化機制。1.Western blot法顯示,在人臍靜脈內皮細胞沉默Endophilin A2對EGFR、Met、VEGFR2的蛋白表達均無顯著性變化。同樣的過表達Endophilin A2亦不影響內皮細胞中EGFR、Met、VEGFR2的表達(p0.05,n=6)。2.Western blot方法顯示,在VEGF 10ng/ml 5min誘導下,沉默Endophilin A2后,VEGFR2Tyr951、Tyr1059、Tyr1175位點磷酸化水平與相應對照組相比顯著降低,(p0.05,n=6),而過表達Endophilin A2后,在VEGF10ng/ml 5min刺激下,VEGFR2Tyr951、Tyr1059、Tyr1175位點磷酸化水平與相應對照組相比顯著升高(p0.05,n=6)。3.Western blot的結果中我們觀察到,沉默Endophilin A2的蛋白表達可以顯著減少VEGF誘導的p-PI3K、p-AKT、p-Src的表達(p0.05,n=6)。相反,過表達Endophilin A2,Endophilin A2過表達組中VEGF誘導的Src、PI3K、AKT磷酸化水平與對照組相比顯著升高(p0.05,n=6)。4.Western blot的結果中我們觀察到,沉默Endophilin A2的蛋白表達,與對照組相比Endophilin A2干擾組中VEGF誘導的PLCγ、ERK、p38的磷酸化水平顯著降低(p0.05,n=6)。相反,過表達Endophilin A2,VEGF誘導的PLCγ、ERK、p38的磷酸化水平與對照組相比顯著升高(p0.05,n=6)。5.在人臍靜脈內皮細胞,免疫熒光結果顯示Endophilin A2與VEGFR2主要集中分布于胞漿和胞膜中,具有明顯的共定位。在共轉染Endophilin A2-RFP和VEGFR2-myc質粒的COS7細胞中,實驗結果顯示,Endophilin A2與VEGFR2同樣具有明顯的共定位特性,提示Endophilin A2與VEGFR2很有可能存在相互作用。6.免疫共沉淀方法顯示,在人臍靜脈內皮細胞中Endophilin A2和VEGFR2之間存在著相互結合。進一步在外源性轉染Endophilin A2-Flag和VEGFR2-myc質粒的COS7細胞株中,證實了Endophilin A2與VEGFR2間的相互結合作用。7.Co-IP實驗結果顯示,當SH3結構域缺失后,Endophilin A2與VEGFR2相互作用依然存在,當PRD結構域缺失后,Endophilin A2與VEGFR2也依然存在相互作用,而當N-BAR結構域缺失后,二者相互作用消失,提示Endophilin A2是通過N-BAR結構域與VEGFR2相互結合。8.Co-IP實驗結果顯示,VEGFR2和Endophilin A2(1-245aa)無相互作用,而與Endophilin A2(1-200aa)和Endophilin A2(1-175aa)存在結合,說明VEGFR2和Endophilin A2的結合位置在其N-BAR結構域200-245aa。9.免疫共沉淀方法顯示在VEGF 50ng/ml刺激15min下,Endophilin A2與VEGFR2的結合顯著增加。Con組和加VEGF組二者的結合率分別是0.74±0.17和1.71±0.4(p0.05,n=6)。10.在VEGF 50ng/ml刺激15min下,沉默Endophilin A2發(fā)現,VEGFR2 dimer(460KDa)/VEGFR2 moner(230KDa)比值與對照組相比明顯減少。過表達Endophilin A2,VEGFR2 dimer(460KDa)/VEGFR2 moner(230KDa)比值與對照組相比明顯增多(p0.05,n=4)。11.內皮細胞上免疫共沉淀結果發(fā)現,VEGFR2與Src激酶在VEGF誘導的內皮細胞中存在相互結合,Endophilin A2通過SH3結構域可以和Src發(fā)生結合,采用免疫共沉淀的方法,在沉默Endophilin A2后,VEGF刺激下,VEGFR2與Src的結合與對照組相比明顯減少(p0.05,n=6),同時過表達Endophilin A2后,VEGFR2與Src的相互作用與對照組相比明顯增多(p0.01,n=6)。在COS7細胞中分別轉染VEGFR2-myc質粒,同時分別轉染Endophilin A2(FL)-Flag全長質粒和Endophilin A2-△N-BAR-Flag質粒,結果發(fā)現,轉染△N-BAR-Flag質粒組VEGFR2與Src結合明顯少于轉染Endophilin A2(FL)-Flag全長質粒組(p0.05,n=6)。12.采用免疫共沉淀方法,發(fā)現在內皮細胞上,Endophilin A2與PLCγ存在相互結合。進行免疫共沉淀定量檢測,發(fā)現在沉默Endophilin A2后,在VEGF刺激下,VEGFR2與PLCγ的結合與對照組相比明顯減少(p0.05,n=6),同時過表達Endophilin A2后,VEGFR2與PLCγ的相互作用與對照組相比明顯增多(p0.01,n=6)。小結1.Endophilin A2通過與VEGFR2結合,促進VEGFR2二聚體的形成,進而增加VEGFR2的自身磷酸化水平,促進VEGFR2/PI3K/AKT,VEGFR2/Src以及VEGFR2/PLCγ/MAPK信號通路活化。2.VEGF作用增強Endophilin A2與VEGFR2結合,提示VEGFR2的磷酸化水平可能是調控兩者結合水平的重要因素。3.Endophilin A2通過其N-BAR結構域的200-245個氨基酸序列與VEGFR2結合,而通過SH3結構域與Src相互結合,進而促進VEGF誘導的VEGFR2/Src復合物形成,進一步促進Src信號通路轉導。4.Endophilin A2與PLCγ存在相互作用,Endophilin A2通過促進VEGF誘導的VEGFR2與PLCγ復合物形成,進一步促進VEGFR2/PLCγ/MAPK信號通路轉導。第三部分Endophilin A2抑制內皮細胞凋亡作用及機制建立CHX+TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡體外模型,應用Endophilin A2敲除小鼠和小分子RNA干擾、腺病毒轉染、免疫共沉淀、免疫印跡、免疫熒光、流式細胞技術、Tunel檢測細胞凋亡等方法,探討Endophilin A2對CHX+TNF-α誘導內皮細胞凋亡的作用及機制。1.采用后肢缺血小鼠腓腸肌組織切片使用原位細胞凋亡試劑盒與Hochest共染,結果發(fā)現,Endophilin A2敲除小鼠缺血組中細胞凋亡紅色熒光數量明顯多于WT小鼠缺血組細胞凋亡紅色熒光數量。2.流式細胞術AnnexinV APC/7AAD雙染法定量檢測凋亡率,CHX+TNF-αNegative組早期凋亡率為19.4±6.0,與Negative組相比,CHX+TNF-αEndophilin A2 Si RNA組早期凋亡率顯著升高至34.0±6.8(p0.01,n=6)。相反,CHX+TNF-αAd-Endo A2組早期凋亡率與CHX+TNF-αAd-GFP組相比顯著降低(p0.05,n=6)。3.Hochest染色顯示正常細胞核呈圓形或者橢圓形,顯示均勻的藍色熒光。給予CHX+TNF-α處理,引起核固縮,染色質呈致密濃染的狀態(tài)及凋亡小體形成。沉默Endophilin A2后再給予處理CHX+TNF-α8h,與對照處理組相比,凋亡形態(tài)學改變加重,核固縮及凋亡小體增加(n=6)。而過表達Endophilin A2則會緩解CHX+TNF-α處理引起的凋亡形態(tài)學改變和凋亡小體形成(n=6)。4.Western blot結果發(fā)現,沉默Endophilin A2后,在CHX+TNF-α誘導下CD31的表達明顯少于對照組(p0.05,n=6),同時過表達Endophilin A2后,CD31的表達明顯多于對照組(p0.01,n=6)。5.在CHX+TNF-α誘導下,沉默Endophilin A2后,western blot結果顯示Caspase3總蛋白表達明顯減少,而其切割體cleaved Caspase3表達量明顯增多,cleaved Caspase3/Caspase3比值明顯增多(p0.05,n=6)。而過表達Endophilin A2后,結果顯示Caspase3總蛋白表達明顯增多,而其切割體cleaved Caspase3表達量明顯減少,cleaved Caspase3/Caspase3比值明顯減少(p0.01,n=6)。6.在CHX+TNF-α誘導下,沉默Endophilin A2后,結果顯示Caspase9總蛋白表達明顯減少,而其切割體cleaved Caspase9表達量明顯增多,cleaved Caspase9/caspase9比值明顯增多(p0.01,n=6)。而過表達Endophilin A2后,結果顯示Caspase9總蛋白表達明顯增多,而其切割體cleaved Caspase9表達量明顯減少,cleaved Caspase9/Caspase9比值明顯減少(p0.05,n=6)。7.在CHX+TNF-α誘導下,在沉默Endophilin A2后,結果顯示Bax蛋白表達明顯增多(p0.05,n=6)。而Bcl-2的蛋白表達明顯減少(p0.05,n=6)。8.Western blot方法顯示,在CHX+TNF-α誘導下,沉默Endophilin A2后,結果顯示p53蛋白表達明顯增多(p0.05,n=6)。而過表達Endophilin A2后,結果顯示p53蛋白表達明顯增減少(p0.05,n=6)。9.采用免疫共沉淀的方法,結果發(fā)現Endophilin A2與p53存在相互作用。在外源性上,我們采用COS7細胞轉染Endophilin A2-Flag全長質粒,用p53去沉淀Endophilin A2外源性標簽Flag,發(fā)現Endophilin A2與p53存在外源性結合。10.Co-IP實驗結果發(fā)現PRD端缺失后,Endophilin A2與p53仍存在結合,而C端SH3缺失質粒未見結合,因此Endophilin A2通過C端SH3結構與p53結合。11.Western blot結果顯示,過表達EndophilinA2,p53的蛋白表達降低;預孵MG132后,Endophilin A2+MG132組p53蛋白表達與過Endophilin A2組相比顯著升高(p0.05,n=4)。小結1.敲除Endophilin A2增加后肢缺血誘導的細胞凋亡。2.Endophilin A2可抑制TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡。3.Endophilin A2通過SH3結構域與p53結合,調控p53表達,進而調控線粒體上p53相關靶蛋白Bax和Bcl-2的表達,抑制Caspse9-Caspase3信號通路,抑制內皮細胞凋亡。4.Endophilin A2通過蛋白酶體通路降解作用調控p53的蛋白表達變化。結論1.Endophilin A2通過N-BAR結構域的200-245個氨基酸位點與VEGFR2結合,促進VEGF誘導的VEGFR2二聚體形成和受體自身磷酸化。2.Endophilin A2促進VEGFR2/Src以及VEGFR2/PLCγ復合物形成,促進VEGFR2/PI3K/AKT,VEGFR2/Src以及VEGFR2/PLCγ/MAPK信號轉導。3.Endophilin A2通過蛋白酶體通路降解作用下調p53表達,穩(wěn)定線粒體膜,抑制內皮細胞凋亡。4.敲除Endophilin A2抑制血管新生,而內皮細胞高表達Endophilin A2則促進血管新生。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中山大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R363
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本文編號：2430919