【摘要】：目的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)炎性脫髓鞘的自身免疫性疾病。前期研究表明,具有補(bǔ)腎化痰活血作用的補(bǔ)腎益髓方能減緩MS的小鼠模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的軸突損傷,并促進(jìn)其再生修復(fù),但其作用機(jī)制還不明確。因此,在前期研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合目前國內(nèi)外有關(guān)軸突再生機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的研究,應(yīng)用免疫組化、實(shí)時熒光定量PCR(quantitative RT-PCR,qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)等技術(shù),以軸突再生神經(jīng)營養(yǎng)因子為研究重點(diǎn),探討補(bǔ)腎益髓方及其拆方對EAE小鼠軸突損傷和修復(fù)的作用及分子機(jī)制,以揭示中醫(yī)補(bǔ)腎化痰活血法的現(xiàn)代內(nèi)涵,為中醫(yī)藥辨證論治MS及相關(guān)疑難重癥提供科學(xué)依據(jù)。方法140只C57BL/6雌性小鼠,隨機(jī)分為正常對照(normal control,NC)、模型(model,MO)、醋酸潑尼松(prednisone acetate,PA,5mg/kg)、梓醇(catapol,CA,40mg/kg)、補(bǔ)腎益髓方(BSYS,3.02g生藥/kg)、補(bǔ)腎方(BS,1.44g生藥/kg)、化痰活血方(HTHX,1.57g生藥/kg)組,每組20只。用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55免疫小鼠制備EAE模型。各治療組予相應(yīng)藥物灌胃,NC和模型組灌服生理鹽水,每日1次,共40天。每日記錄小鼠體重和神經(jīng)功能評分,統(tǒng)計小鼠發(fā)病率和死亡率。在EAE小鼠發(fā)病第20天(急性期)和第40天(緩解期)取腦和脊髓。蘇木素伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)觀察其病理變化;透射電鏡觀察軸突和髓鞘變化;免疫組化法(immunohistochemistry,IHC)檢測P-tau與beta-tubulin的表達(dá);應(yīng)用qRT-PCR、WB法測定BDNF/TrkB/PI3K/AKT mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果1補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方和化痰活血方對EAE小鼠神經(jīng)保護(hù)的作用1.1補(bǔ)腎益髓方及其拆方對EAE小鼠發(fā)病情況的影響造模前各組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。造模后各小鼠體重緩慢上升,于第11天開始,與正常組比較,其他各造模組小鼠體重開始出現(xiàn)明顯下降(P0.05)。于第19天降至最低,后緩慢回升。但第19天到第40天各造模組動物體重均較正常組顯著降低(P0.01)。在第23天到40天,補(bǔ)腎益髓方和補(bǔ)腎組小鼠體重與激素組比較,回升明顯(P0.05或P0.01)。1.2補(bǔ)腎益髓方及其拆方對EAE小鼠病理改變的影響模型組腦白質(zhì)血管周圍有炎細(xì)胞浸潤,核固縮明顯。激素、梓醇、補(bǔ)腎、化痰活血和補(bǔ)腎一歲組腦白質(zhì)血管周圍有炎細(xì)胞浸潤,部分核固縮。病理程度較模型組低。脊髓病理變化與腦相似。1.3補(bǔ)腎益髓方及其拆方對EAE小鼠軸突損傷及修復(fù)的影響各組小鼠發(fā)病第20天和第40天,模型組中p-Tau表達(dá)明顯上調(diào),beta-tubulin表達(dá)明顯下調(diào),補(bǔ)腎益髓、補(bǔ)腎和化痰活血方均可明顯下調(diào)p-Tau表達(dá)(P0.05,P0.01),上調(diào)beta-tubulin蛋白表達(dá)(P0.05,P0.01)。2 BSYS及其拆方對EAE小鼠軸突修復(fù)的作用機(jī)制研究綜合qRT-PCR、WB檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)病第20天和40天,補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方與化痰活血方均可明顯上調(diào)EAE小鼠腦和脊髓BDNF、TrkB、PI3K與AKT mRNA的表達(dá),與模型組相比,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。補(bǔ)腎益髓方對上述各指標(biāo)的作用趨勢優(yōu)于拆方補(bǔ)腎與化痰活血方,但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論補(bǔ)腎益髓方及其拆方補(bǔ)腎方與化痰活血方均對EAE小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用,表現(xiàn)在減少體重丟失,降低神經(jīng)功能評分,減輕炎性細(xì)胞浸潤,減輕軸突損傷及促進(jìn)其修復(fù),尤以補(bǔ)腎益髓全方更為顯著。其作用機(jī)制可能與與增強(qiáng)BDNF/TrkB及其信號通路PI3K/AKT表達(dá)有關(guān)。補(bǔ)腎方的作用與補(bǔ)腎益髓方作用相似,但化痰活血方作用不及前二者。這些結(jié)果為補(bǔ)腎益髓方治療MS提供了部分科學(xué)依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2430434