【摘要】：背景及目的:現(xiàn)有對(duì)于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)的研究主要是通過(guò)M.tb的自身成分或其分泌成分刺激誘導(dǎo)不同免疫細(xì)胞(DC細(xì)胞、γδT細(xì)胞等)來(lái)研究其相關(guān)作用機(jī)制,但對(duì)于抵御M.tb入侵肺部過(guò)程中發(fā)揮重要作用的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial typeⅡcell,AT2)的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。已知臨床上廣泛使用的結(jié)核病(tuberculosis,TB)疫苗-卡介苗(Bacille-Calmette-Guerin,BCG)存在著對(duì)成人肺結(jié)核保護(hù)不穩(wěn)定的不足,因此新靶向藥物的研發(fā)也成為TB治療的新研究課題。本實(shí)驗(yàn)研究從M.tb入侵人體肺部的重要屏障——AT2細(xì)胞為切入點(diǎn),選用與AT2細(xì)胞具有相同表型和特征的人肺腺癌細(xì)胞系(human lung adenocarcinoma cell line,A549)細(xì)胞,通過(guò)結(jié)核桿菌耐熱抗原(Mycobacterium tuberculosis heat-resistant antigen,Mtb-HAg)刺激誘導(dǎo)A549細(xì)胞,探討對(duì)A549細(xì)胞分泌肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B(pulmonary surfactant-associated protein B,SP-B)的作用和對(duì)其凋亡的影響。進(jìn)而間接研究Mtb-HAg對(duì)AT2細(xì)胞分泌SP-B和凋亡的作用,為較好的研究肺部感染TB早期AT2細(xì)胞抵御M.tb入侵的機(jī)制提供新的理論依據(jù);同時(shí)初步探究Mtb-HAg對(duì)AT2細(xì)胞的凋亡作用,為進(jìn)一步深入研究其作用通路提供新的思路。方法:(1)用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%雙抗的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Media,DMEM)培養(yǎng)基,在37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞;用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的Mtb-HAg工作液,分別刺激誘導(dǎo)A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h,48 h,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。(2)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法分別檢測(cè)空白對(duì)照組1、陽(yáng)性對(duì)照組(脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h)和實(shí)驗(yàn)組1(不同濃度的Mtb-HAg分別刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h,48 h)的培養(yǎng)上清中SP-B的表達(dá)量。(3)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR)法分別檢測(cè)空白對(duì)照組1、陽(yáng)性對(duì)照組(LPS刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h)和實(shí)驗(yàn)組1(不同濃度的Mtb-HAg分別刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h,48 h)中目的基因SFTPB的相對(duì)表達(dá)量變化。(4)運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)分別檢測(cè)空白對(duì)照組2、陽(yáng)性對(duì)照組(姜黃素刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h)和實(shí)驗(yàn)組2(不同濃度的Mtb-HAg分別刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h)的細(xì)胞凋亡率變化。結(jié)果:(1)與空白對(duì)照組1相比,誘導(dǎo)培養(yǎng)相同時(shí)間,陽(yáng)性對(duì)照組(LPS組)和實(shí)驗(yàn)組1(不同濃度Mtb-HAg刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)相同時(shí)間)的SP-B表達(dá)量顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)組1(相同濃度Mtb-HAg刺激誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間)的SP-B表達(dá)量降低不明顯(P0.05)。(2)相同培養(yǎng)時(shí)間,實(shí)驗(yàn)組1(不同濃度的Mtb-HAg刺激誘導(dǎo)培養(yǎng))和陽(yáng)性對(duì)照組(LPS組)中基因SFTPB的相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組1,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而在相同的Mtb-HAg優(yōu)勢(shì)刺激誘導(dǎo)濃度下,實(shí)驗(yàn)組1基因SFTPB的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間變化不顯著,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)陽(yáng)性對(duì)照組(姜黃素組)的A549細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組2,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)組2中A549細(xì)胞的凋亡率均與空白對(duì)照組2相比,均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但實(shí)驗(yàn)組2之間A549細(xì)胞的凋亡率變化不顯著(P0.05)。結(jié)論:(1)Mtb-HAg對(duì)AT2細(xì)胞的體外模型A549細(xì)胞的SP-B分泌和其表達(dá)SP-B的基因SFTPB的表達(dá)具有抑制作用,從而有利于更好的研究AT2細(xì)胞在M.tb侵入人體肺部初期時(shí)發(fā)揮作用的機(jī)制。(2)Mtb-HAg可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,為M.tb的Mtb-HAg對(duì)于人AT2細(xì)胞的凋亡作用機(jī)制研究提供新的途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2425386