【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是較常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,目前沒有很好的藥物治療。近年來,中藥及其中藥單體成分對PD的治療或輔助治療越來越受到人們的關(guān)注。芍藥苷(paeoniflorin,PF)為中藥芍藥的主要有效單體成分,具有神經(jīng)保護作用。本課題旨在探討PF對魚藤酮致PD模型損傷的保護作用及機制,期望為PD的治療提供新的思路和方法。本實驗首先利用魚藤酮作用于C57BL/6小鼠致PD體內(nèi)模型,評價PF是否具有神經(jīng)保護作用。如果小鼠體內(nèi)實驗具有神經(jīng)保護作用,則利用魚藤酮作用于SH-SY5Y細胞株致PD體外模型,進行PF神經(jīng)保護作用機制的研究。利用C57BL/6小鼠進行體內(nèi)實驗。雄性C57BL/6健康小鼠43只,體重20±2 g。動物適應性飼養(yǎng)觀察一周后,稱重。先隨機分為3組:正常組(n=6)、溶劑組(含2%DMSO的橄欖油溶液)(n=7)和模型組(魚藤酮橄欖油溶液)(n=30)。利用魚藤酮接觸式給藥致C57BL/6小鼠PD模型。在造模第31天、32天、33天、34天、35天、36天和40天時,進行轉(zhuǎn)棒實驗,初步評價模型是否成功。接觸式給藥40天后,剔除造模不成功的動物4只。將造模成功的動物26只,再隨機分為3組:模型組(給予魚藤酮7.5 mg/kg)(n=9)、陽性藥物組(給予7.5 mg/kg魚藤酮和120 mg/kg美多芭)(n=8)和PF治療組(給予7.5 mg/kg魚藤酮和5 mg/kg PF)(n=9)。第41~49天,魚藤酮處理3 h后,動物灌胃給藥,一天一次。正常組、溶劑組、模型組灌胃無菌水,陽性藥物組和PF治療組分別灌胃給于美多芭和PF溶液。每日一次,持續(xù)給藥9天。采用轉(zhuǎn)棒實驗觀察藥物干預前后小鼠行為學的變化,以小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間表征小鼠的平衡能力,并對小鼠平衡能力進行評分。行為學檢測后,每組隨機選取3只小鼠,用5%的水合氯醛麻醉小鼠,迅速打開胸腔,經(jīng)左心室灌注生理鹽水,待肝組織變白后改用4%的多聚甲醛灌注固定,完畢后迅速取出腦組織,用4%的多聚甲醛固定24h以上,從固定液中取出腦組織,進行酒精梯度脫水(50%乙醇40min,70%乙醇40 min,90%乙醇25 min,100%乙醇15 min,100%乙醇15 min),透明(二甲苯Ⅰ15 min,二甲苯Ⅱ15 min),浸蠟90 min,包埋,腦組織冠狀切片,5μm厚度,進行HE染色。利用魚藤酮誘導SH-SY5Y損傷模型作為PD研究的體外模型,待細胞貼壁生長匯合度達到70-80%時,消化分組。實驗分為正常組、0.0125%DMSO溶劑組、魚藤酮模型組、魚藤酮和美多芭同時給藥組、魚藤酮加PF組(PF設(shè)置三個濃度組)。魚藤酮終濃度為0.25μmol·L-1,美多芭的終濃度為15μmol·L-1(以左旋多巴計),PF的終濃度分別為0.08μmol·L-1、0.4μmol·L-1、2μmol·L-1,藥物作用于細胞24 h后,采用MTT法檢測細胞活力,采用微量酶標法測定上清液中的乳酸脫氫酶的活力,采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),Western Blot檢測細胞中α-synuclein的表達情況,HE染色檢測Lewy的形成。體內(nèi)動物實驗中,溶劑組和正常組相比,小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時間無顯著性差異;模型組與溶劑組相比,在轉(zhuǎn)棒上停留時間明顯縮短(P0.05);陽性藥物組和PF治療組與模型組相比,在轉(zhuǎn)棒上停留時間明顯延長。HE染色后,正常和溶劑組炓質(zhì)致密部(substantia nigra compact,SNC)細胞核清晰,神經(jīng)元形態(tài)完整,排列整齊,核仁明顯。模型組與溶劑組相比,神經(jīng)元數(shù)目減少,核仁不明顯,胞漿濃染。給予美多芭和芍藥苷以后,可以逆轉(zhuǎn)上述變化。在體外細胞實驗中,溶劑組和正常組相比,細胞活力沒有顯著性差異(P0.05),LDH活力也沒有明顯差異(P0.05);模型組和溶劑組相比,細胞活力下降(P0.05)、LDH活力明顯升高(P0.05)、細胞突觸變短,細胞變圓、細胞數(shù)量減少,Lewy明顯增多(p0.05),α-synuclein表達量明顯增多。加入美多芭和PF以后,可以逆轉(zhuǎn)上述變化。綜上所述,PF對魚藤酮致帕金森模型具有神經(jīng)保護作用,減少Lewy的形成和降低α-synuclein的表達有關(guān)。
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【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2417117