【摘要】：胃腸道長期暴露于大量外來抗原刺激,包括共生菌、致病菌、腸道內(nèi)容物,宿主通過多種途徑維持腸道的免疫穩(wěn)態(tài)。腸道粘膜是輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)分化成熟的天然場所,Thl7可分泌白細胞介素17A(Interleukin17A,IL-17A),白細胞介素17F (Interleukinl 7F, IL-17F),白細胞介素21(Interleukin21,IL-21),白細胞介素22 (Interleukin22, IL-22). IL-17作為Th17的代表細胞因子,能刺激腸道上皮細胞分泌抗菌肽。研究還發(fā)現(xiàn)胃腸道和肺中的Th17可以誘導粘膜免疫球蛋白(immunoglobulin A, IgA)。IL-17A和IgA可以協(xié)助維持腸道穩(wěn)態(tài)。盡管Thl7在不同的實驗模型中表現(xiàn)出促進炎癥或抑制炎癥的作用,已有研究表明這些細胞在腸道粘膜穩(wěn)態(tài)中起到重要作用,尤其是在含有大量共生菌群時。但能夠促進腸道Th17的分化成熟的細胞和環(huán)境因素仍需要進一步的研究。樹突狀細胞(Dendritic cells, DCs)在大腸和小腸固有層廣泛分布,形成緊密的網(wǎng)絡,可以調(diào)節(jié)腸道對共生菌產(chǎn)生的固有免疫和適應性免疫應答。樹突狀細胞通過表達歸巢受體α4β7和CCR9指導淋巴細胞歸巢,使其再循環(huán)至腸道。因此,樹突狀細胞在控制腸道炎癥及維持免疫穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。腸道固有層存在多種亞型的樹突狀細胞,根據(jù)來源不同及表型,通常將其分CD11c+CD11b+CD8α-樹突狀細胞即髓系樹突狀細胞(myloid DC, mDC), CD11c+CD11b-CD8a+樹突狀細胞即淋巴系樹突狀細胞(lymphoid DC, IDC), CD11c+CD11b-B220+樹突狀細胞即漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid DC,pDC)。小腸中部分樹突狀細胞表達CX3CR1, CX3CR1+DC通過上皮間樹突狀細胞對腸內(nèi)容物檢測取樣從而決定微生物的攝取,進而“守衛(wèi)”胃腸道粘膜屏障。近期研究表明一些亞型的腸道固有層樹突狀細胞表達CD103,而CD103+和CD103-腸道固有層樹突狀細胞在介導B淋巴細胞分泌IgA及腸道營養(yǎng)T淋巴細胞起到不同的作用,即調(diào)節(jié)T淋巴細胞和B淋巴細胞反應。根據(jù)CD103和CDllb的表達將腸道樹突狀細胞分為四群,但不同亞群的樹突狀細胞在腸內(nèi)微生物抗原攝取、遞呈中的作用仍不明了。另外這四種不同的樹突狀細胞對腸道微生物免疫應答的機制到底是協(xié)同合作還是各有分工;如何調(diào)節(jié)適應性免疫,怎樣誘導不同的T淋巴細胞分化發(fā)育仍有待進一步研究。一系列研究顯示DCs對不同微生物刺激的應答表現(xiàn)出明顯的靈活性或“可塑性”,但更多的證據(jù)表明不同亞型的DC在抗原遞呈、刺激不同類型免疫應答的能力上存在本質(zhì)的差異。研究發(fā)現(xiàn)多種不同亞型的樹突狀細胞表達不同的Toll樣受體(TLRs),對微生物刺激的反應也不同。比如,CD8α-樹突狀細胞有較強的吞噬能力,CD8a+樹突狀細胞可以內(nèi)化凋亡細胞。只有髓系樹突狀細胞(mDC)可以識別TLR3,4,7,9,并釋放IL-23,IL-12。漿細胞樣樹突狀細胞同樣可以分泌IL-12,但卻不能識別TLR3,4,7,9。表達TLR5的CD103+CD11b+樹突狀細胞通過激活TLR5信號通路識別鞭毛激發(fā)固有免疫應答,釋放IL-6促進腸內(nèi)Th17分化,因此推測腸道固有層樹突狀細胞可以誘導Th17分化可能與TLR5相關(guān)。信號調(diào)節(jié)蛋白α(Signal regulatory protein alpha, SIRPα/CD172a)是一種保守型跨膜蛋白。CD172α陽性腸道固有層樹突狀細胞能促進Th17成熟分化。TLR5是否介導CD172α陽性腸道固有層樹突狀細胞識別共生菌、激發(fā)免疫應答、誘導Th17分化,從而控制免疫穩(wěn)態(tài)及腸道炎癥需要進一步研究�；谝陨侠碚摵脱芯�,本文分兩個部分對以上問題進行探討：1、腸系膜淋巴結(jié)與腸固有層樹突狀細胞TLR5和CD172α表達量不同誘導不同T細胞免疫應答；2、TLR5介導CD 172 α+腸道固有層樹突狀細胞誘導微生物抗原特異性Th17成熟分化。研究內(nèi)容：第一部分：1.自CBirl轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)分離脾CD4陽性T淋巴細胞本研究中依據(jù)Cao等人提取脾CD4陽性T淋巴細胞經(jīng)典方法,利用CD4特異性的顯微磁珠,對脾內(nèi)淋巴細胞進行陽性分選,流式細胞術(shù)分析CD4陽性細胞率約為75%-80%。2.CBir1鞭毛蛋白刺激體內(nèi)脾T淋巴細胞產(chǎn)生Thl型免疫反應為了研究T細胞對菌群的反應,將羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE)標記的CBirl特異性CD4陽性T淋巴細胞通過尾靜脈注射過繼回輸?shù)絋淋巴細胞受體p鏈和δ鏈敲除(TCRβ×δ-/-)小鼠體內(nèi)。TCRβ×δ-/-小鼠因腸道IgA絕對減少,CBirl特異性CD4陽性T淋巴細胞可以穿過上皮層。給受體小鼠灌胃重組的CBirl鞭毛蛋白,三天后處死,分離脾淋巴細胞,流式檢測細胞內(nèi)因子干擾素γ(interferonγ,IFN-γ)和IL-17A的陽性細胞數(shù),發(fā)現(xiàn)脾內(nèi)的CBirl轉(zhuǎn)基因T細胞只分泌IFN-γ,不分泌IL-17A。3.CBir1鞭毛蛋白刺激體內(nèi)腸固有層內(nèi)T淋巴細胞既可以產(chǎn)生Th1型免疫反應,也可以產(chǎn)生Th17型免疫反應。將CFSE標記的CBirl特應性的T淋巴細胞過繼回輸?shù)絋CRβ×6基因敲除小鼠體內(nèi),同時灌胃CBirl鞭毛蛋白。本研究中依據(jù)Cong等人提取腸道固有層淋巴細胞的經(jīng)典方法,利用膠原酶消化,梯度離心,得到腸道固有層淋巴細胞,再用PMA和Ionomycin刺激5小時,與Pacific Blue結(jié)合的CD4陽性的流式抗體標記、分選出CD4陽性的T淋巴細胞,檢測其IFN-γ和IL-17A的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸道固有層CBirl轉(zhuǎn)基因T細胞既分泌IFN-γ也分泌IL-17A。4.分離提取脾、腸道固有層樹突狀細胞利用autoMAC磁性分選儀及CDllc抗體標記的顯微磁珠對脾、腸道固有層淋巴細胞進行陽性分選,流式細胞術(shù)檢測CD11c陽性率約為75%。5.CBirl鞭毛蛋白刺激脾樹突狀細胞體外誘導CBirl特異性T細胞分化為Thl已有研究報道樹突狀細胞可以指導T細胞發(fā)育為不同亞型,所以進一步研究是否因為脾內(nèi)樹突狀細胞和腸道固有層樹突狀細胞的不同導致Thl和Thl7分化結(jié)果不同。將CBirl特異性T細胞與脾樹突狀細胞共培養(yǎng),給予有TLR5活性的全長CBirl鞭毛蛋白或無TLR5活性的CBirl多肽,用流式細胞術(shù)檢測FN-γ和IL-17A的表達。給予CBirl多肽和CBirl鞭毛蛋白處理T細胞都分泌大量的IFN-γ。6.CBir1鞭毛蛋白刺激腸道固有層樹突狀細胞體外誘導CBirl特異性T細胞分化為Th1和Th17將CBir1特異性T細胞與脾樹突狀細胞共培養(yǎng),給予有TLR5活性的全長CBirl鞭毛蛋白或無TLR5活性的CBir1多肽,用流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)給予CBir1多肽的處理組,與腸道固有層樹突狀細胞共培養(yǎng),CBir1特異性T細胞只產(chǎn)生IFN-γ而不產(chǎn)生IL-17A；給予全長CBir1鞭毛蛋白的處理組,與腸道固有層樹突狀細胞共培養(yǎng)的CBir1特異性T細胞即表達IFN-γ也表達IL-17A。7.腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymph nodes,MLN)樹突狀細胞和腸固有層樹突狀細胞具有攝取CBirl鞭毛蛋白的能力為檢測MLN樹突狀細胞和腸道固有層樹突狀細胞是否可以攝取粘膜表面的CBir1鞭毛蛋白,給予正常野生型小鼠或TCRβ×δ-/-小鼠Alexa 647標記CBir1鞭毛蛋白灌胃處理。(Alex 647標記CBirl鞭毛蛋白與不標記的CBirl鞭毛蛋白刺激CBir1特異性T細胞增殖的能力相同,而且細胞因子的表達也沒有差異。)2小時后,提取MLN樹突狀細胞和腸道固有層樹突狀細胞,流式分析CBirl鞭毛蛋白的攝取量.TCRβ×δ-/-小鼠體內(nèi)MLN樹突狀細胞和腸道固有層樹突狀細胞都是Alexa 647陽性的,而正常野生型的為陰性。8.腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymph nodes,MLN)樹突狀細胞和腸固有層樹突狀細胞具有攝取CBir1鞭毛蛋白并刺激T淋巴細胞免疫能力分別從CBir1轉(zhuǎn)基因小鼠和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠(OT-II小鼠)體內(nèi)分離提取CBir1特異性T細胞和OVA特異性T細胞,與TCRβ×δ-/-小鼠體內(nèi)提取的攜帶CBirl鞭毛蛋白的腸道固有層樹突狀細胞共同培養(yǎng),檢測T細胞增殖。腸道固有層樹突狀細胞可以刺激CBir1特異性T淋巴細胞增殖,不能刺激OVA特異性T細胞增殖。CBir1鞭毛蛋白灌胃處理的野生型小鼠的腸道固有層樹突狀細胞不能刺激CBir1特異性T增殖；PBS灌胃的TCRβ×δ-/-小鼠的腸道固有層樹突狀細胞可以刺激CBir1特異性T細胞增殖,但增殖水平較低。第二部分：1.脾、腸道固有層樹突狀細胞TLR5和CD172a的表達不同亞型的樹突狀細胞存在于不同組織中,已有研究確定腸道固有層內(nèi)存在髓系樹突狀細胞(表型為CD11c+CD11b+CD8α-),淋巴系樹突狀細胞(表型為CD11+c+CD11b-CD8a+),漿細胞樣樹突狀細胞(表型為CD11c+CD11b-B220+)。樹突狀細胞可以表達多種Toll樣受體,所以我們利用流式檢測TLR5和CD172 a在脾和腸道固有層各種亞型(CD103+, CD103-, CD11b+,CD11b-)樹突狀細胞的表達。過去有研究認為,與脾樹突狀細胞相比,多數(shù)CD11c陽性腸道固有層DC表達TLR5。本文研究結(jié)果表明CD11c+CD11b+和CD11c+CD11b-樹突狀細胞都表達TLR5,但是在雙陽性的CD11c+CD11b+腸道固有層樹突狀細胞中TLR5表達量比單陽性C D11c+CDllb-腸道固有層樹突狀細胞高。這些結(jié)果與之前用Alexa標記的CBir1鞭毛蛋白作為TLR5的受體確定了TLR5不是CBir1鞭毛菌的特異性受體的結(jié)果相吻合。2.脾樹突狀細胞受LPS刺激激活免疫反應；腸道固有層樹突狀細胞受CBir1鞭毛蛋白刺激激活免疫反應。為檢測脾樹突狀細胞和固有層樹突狀細胞不同的TLR5的表達量是否影響他們對CBir1鞭毛菌刺激的免疫應答,分別用全長的CBir1鞭毛蛋白或帶有鞭毛的可以產(chǎn)生CBir1鞭毛蛋白的A4菌處理C57BL/6小鼠的脾樹突狀細胞或腸道固有層樹突狀細胞。曾經(jīng)研究表明腸固有層樹突狀細胞TLR4的表達量遠遠低于脾樹突狀細胞,所以用脂多糖(lipopolysacchirde, LPS)刺激腸道固有層樹突狀細胞和脾樹突狀細胞作為對照。用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測量細胞培養(yǎng)24小時后上清液中的細胞因子表達。脂多糖刺激脾樹突狀細胞釋放大量IL-12p70和IL-6,少量IL-23；而在CBir1鞭毛蛋白和帶鞭毛的A4菌刺激后釋放更少的IL-12p70和IL-6,相比之下,腸道固有層樹突狀細胞對LPS刺激幾乎沒有免疫反應,但在CBir1鞭毛蛋白和帶鞭毛的A4菌刺激下會釋放大量IL-12p70, IL-23, IL-6。3.TGF-β抗體抑制腸固有層樹突狀細胞誘導Th17極化為探究在CBir1鞭毛蛋白遞呈過程中不同的脾樹突狀細胞和腸內(nèi)固有層樹突狀細胞釋放的不同的細胞因子是否誘導不同的T淋巴細胞免疫,我們將CBir1轉(zhuǎn)基因T細胞和野生型的正常C57BL/6小鼠脾樹突狀細胞或腸道固有層樹突狀細胞共培養(yǎng)；因TGF-β是Th17極化的必要條件,為檢測腸道固有層樹突狀細胞誘導Th17是否有TGF-β介入,我們在T細胞培養(yǎng)是加入TGF-β抗體,用CBir1鞭毛蛋白刺激3天后測量上清液中細胞因子的表達。結(jié)果顯示與腸道固有層樹突狀細胞共培養(yǎng)的CBir1特異性T細胞分泌IFN-γ和IL-17A；與脾樹突狀細胞共培養(yǎng)的CBir1特異性T細胞質(zhì)分泌IFN-γ,不分泌IL-17A。加入TGF-β的抗體可以抑制CBir1特異性T細胞分泌IL-17A,與腸道固有層樹突狀細胞共培養(yǎng)的T細胞分泌IFN-γ增多；與脾樹突狀細胞共培養(yǎng)的T細胞IFN-γ的分泌沒有增多。4.CD172α陽性腸道固有層樹突狀細胞促進微生物抗原特異性Th17免疫應答從野生型正常C57BL/6小鼠腸固有層分離提取CD172α陽性和CD172α陰性的腸道固有層樹突狀細胞,與CBirl特異性T細胞共培養(yǎng),加入可以激活T淋巴細胞和樹突狀細胞TLR5信號通路的全長CBirl鞭毛蛋白,或加入可以激活CBir1 T細胞TLR5卻不能激活樹突狀細胞TLR5的CBirl多肽(因為其缺少TLR5的結(jié)合位點)。加入CBir1鞭毛蛋白或CBir1多肽,CD172α+和CD172α的腸道固有層樹突狀細胞都可以激活T細胞釋放IFN-γ；全長CBirl鞭毛蛋白只能刺激CD172α陽性腸道固有層樹突狀細胞誘導CBir1特異性T細胞產(chǎn)生IL-17A,而CBirl多肽則不能刺激CD172α陽性的腸道固有層樹突狀細胞誘導CBir1特異性T細胞產(chǎn)生IL-17A。CD172α陰性的腸固有層樹突狀細胞即使加入可以激活TLR5信號轉(zhuǎn)導通路的全長CBir1鞭毛蛋白也不能誘導Th17細胞分化發(fā)育。5.TLR5介導CD172α陽性的腸道固有層樹突狀細胞誘導Th17細胞分化發(fā)育為進一步確定TLR5在介導CD172α+的腸道固有層樹突狀細胞誘導Th17細胞分化發(fā)育中的作用,我們從TLR5基因敲除(TLR5-/-)小鼠體內(nèi)分離提取腸道固有層細胞與正常野生型小鼠的腸道固有層樹突狀細胞對比,比較他們在微生物抗原刺激下誘導Th17細胞分化發(fā)育的能力。同時為檢測TLR5基因敲除小鼠的腸固有層樹突狀細胞自身誘導Th17分化的能力是否存在缺陷,我們加入TGF-β檢測TLR5基因敲除的腸道固有層樹突狀細胞是否可以誘導Th17極化。因為全長的CBir1鞭毛蛋白可以激活腸固有層樹突狀細胞表面的TLR5信號轉(zhuǎn)導通路,所以可以刺激野生型腸道固有層樹突狀細胞誘導CBirl特異性T細胞可以產(chǎn)生IL-17A;TLR5基因敲除小鼠腸道固有層樹突狀細胞不能誘導T細胞產(chǎn)生IL-17A；但加入TGF-β后TLR5基因敲除小鼠腸道固有層樹突狀細胞可以誘導T細胞產(chǎn)生IL-17A。野生型和TLR5-/-的腸固有層樹突狀細胞都可以誘導CBir1特異性T細胞分泌IFN-γ。研究結(jié)論：第一部分：1.梭狀芽胞桿菌CBir1特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠脾和腸固有層內(nèi)CBir1特異性T細胞在CBir1鞭毛蛋白刺激下釋放不同細胞因子1)在微生物刺激下,胃腸道環(huán)境使效應T細胞分化為Th1和Th17,但在脾內(nèi),效應T細胞只能分化為Th1。2)全長CBir1鞭毛刺激后,脾樹突狀細胞和腸道固有層樹突狀細胞誘導Th1和Th17的功能存在差異。2.腸系膜淋巴結(jié)樹突狀細胞和腸固有層樹突狀細胞攝取CBir1刺激T淋巴細胞免疫1)MLN樹突狀細胞和腸道固有層樹突狀細胞可以攝取粘膜表面的CBir1鞭毛蛋白。2)腸腔內(nèi)源性CBir1鞭毛菌跨過粘膜屏障被腸道固有層樹突狀細胞攝取,誘導T細胞應答。第二部分：1.脾、腸道固有層樹突狀細胞TLR5和CD172α的表達腸道固有層樹突狀細胞中CD103+的細胞比脾樹突狀細胞中的多。CD103陽性和CD103陰性樹突狀細胞的信號調(diào)節(jié)蛋白α的表達量相同。在胃腸道CD103+和CD103-樹突狀細胞中,大部分的CD172 α陽性的腸固有層樹突狀細胞也表達TLR5。2.CBir1鞭毛菌刺激固有層樹突狀細胞和脾樹突狀細胞產(chǎn)生不同的細胞因子,同時反映出不同的抗原遞呈能力1)脾樹突狀細胞對細菌脂多糖刺激能產(chǎn)生較強的免疫反應,而對CBir1鞭毛蛋白或A4鞭毛菌刺激產(chǎn)生的反應較弱,提示在脾內(nèi)抗原刺激樹突狀細胞誘導T細胞發(fā)生免疫反應主要通過TLR4信號轉(zhuǎn)導通路；腸道固有層樹突狀細胞對LPS刺激基本無反應,而對CBir1鞭毛蛋白或A4鞭毛菌刺激產(chǎn)生的免疫反應較強,提示在腸道內(nèi)抗原刺激樹突狀誘導T細胞發(fā)生免疫反應主要是通過TLR5信號轉(zhuǎn)導通路。2)CBir1鞭毛蛋白刺激脾樹突狀細胞產(chǎn)生Thl型免疫應答；刺激腸固有層樹突狀細胞產(chǎn)生Th17型不同的免疫應答。3.腸固有層Toll樣受體、信號調(diào)節(jié)蛋白α雙陽性樹突狀細胞誘導Th17分化1)微生物抗原刺激CD172a陽性腸道固有層樹突狀細胞誘導Th17細胞分化發(fā)育是由于全長的CBirl鞭毛蛋白激活TLR5信號轉(zhuǎn)導通路；但僅僅激活TLR5信號轉(zhuǎn)導通路不足以啟動Th17細胞發(fā)育增殖。2)TLR5基因敲除的腸固有層樹突狀細胞在體外誘導T細胞分化的能力沒有缺陷,之所以不能誘導T細胞極化是因為缺少Th17極化的必要因素TGF-p。綜上所述,Toll樣受體5通過信號調(diào)節(jié)蛋白a陽性的腸固有層樹突狀細胞促進Th17細胞分化發(fā)育。研究意義與不足：本研究利用微生物抗原刺激流式細胞術(shù)分離的CD172a+腸固有層樹突狀細胞誘導Th17分化,確定了CD172α+腸固有層樹突狀細胞誘導微生物抗原特異性的Th17極化的能力。大部分CD172a+腸固有層樹突狀細胞同樣會表達Toll樣受體5,而TLR5缺陷的腸固有層樹突狀細胞不能誘導Thl7分化發(fā)育。另外,TLR5基因敲除不會影響CD172a陽性腸固有層樹突狀細胞分化發(fā)育。因此本研究首次確定了腸道固有層中誘導Th17分化的樹突狀細胞群的亞型為CD11c+CD172α+TLR5+,進一步的機制研究發(fā)現(xiàn),CD172a陽性的腸固有層樹突狀細胞通過TLR5信號轉(zhuǎn)導通路介導Th17細胞分化,從而指導樹突狀細胞的免疫治療,為今后我們更深入的探討人類消化道疾病的發(fā)病機制和防治策略提供了堅實的理論基礎。該課題不足之處是脾樹突狀細胞在CBir1鞭毛蛋白刺激只能誘導T淋巴細胞分化為Thl型細胞的原因、腸道固有層樹突狀細胞表面其他Toll樣受體的表達及臨床意義仍需要進一步探討。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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