【摘要】：目的建立一套簡單高效的小鼠精原干細(xì)胞(SSCs)分離及體外培養(yǎng)體系,檢測相關(guān)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá),為將SSCs用于抗腫瘤干細(xì)胞藥物的篩選及鑒定奠定基礎(chǔ)。方法采用組織化學(xué)法比較DBA/2乳鼠(6～8天齡)和成年鼠(26～28周齡)曲細(xì)精管解剖結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。選取乳鼠睪丸制備原代細(xì)胞,比較不同消化酶的消化效率。利用差異貼壁法即睪丸體細(xì)胞在明膠上貼壁而精原細(xì)胞不貼壁的特點(diǎn),富集SSCs。比較以StemPro34和α-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系及明膠、血清等因素對(duì)細(xì)胞貼壁及生長性能的影響,觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞形態(tài),免疫熒光法鑒定SSCs及腫瘤干細(xì)胞(CSCs)相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)果乳鼠睪丸中精原細(xì)胞含量相對(duì)較高,胰蛋白酶消化后能獲得較多數(shù)量的原代細(xì)胞。在以StemPro34為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含1%胎牛血清及明膠鋪板的條件下體細(xì)胞貼壁較充分。分離的精原細(xì)胞在以絲裂霉素C處理過的體細(xì)胞為飼養(yǎng)層的環(huán)境中生長良好,呈現(xiàn)出典型的SSCs生長特性,13 d左右可形成明顯的細(xì)胞球。免疫熒光結(jié)果顯示,SSCs標(biāo)記物膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)家族受體α1(GFRα1)及VASA蛋白在細(xì)胞球中高表達(dá);CSCs標(biāo)記物CD44在As、Apr、Aal各期細(xì)胞及細(xì)胞球的內(nèi)部細(xì)胞中均有表達(dá),而體細(xì)胞中則幾乎不表達(dá)。結(jié)論初步建立了DBA/2小鼠SSCs的分離及體外培養(yǎng)體系,CD44在發(fā)育早期的精原細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)。
[Abstract]:Objective to establish a simple and efficient (SSCs) isolation and culture system for mouse spermatogonial stem cells and to detect the expression of related stem cell markers in order to provide a basis for the screening and identification of antitumor stem cell drugs using SSCs. Methods the anatomical characteristics of the seminiferous duct of DBA/2 neonatal rats (68 days old) and adult rats (26 weeks old 28 weeks old) were compared by histochemical method. Primary cells were prepared from the testis of newborn mice and the digestibility of different digestive enzymes was compared. Using differential adherent method, that is, testicular somatic cells adhered to gelatin but spermatogonia did not adhere to the wall, enriched SSCs.. The effects of culture system, gelatin and serum on cell adhesion and growth performance on StemPro34 and 偽-MEM culture medium were compared, and the cell morphology of different culture time was observed. The expression of (CSCs) related markers of SSCs and tumor stem cells was identified by immunofluorescence assay. Results the content of spermatogonium in testis of neonatal rats was relatively high, and a large number of primary cells could be obtained after trypsin digestion. Under the condition of 1% fetal bovine serum and gelatin board, the adherent of somatic cells was more adequate on StemPro34 medium. The isolated spermatogonia grew well in the feeder layer of somatic cells treated with mitomycin C and showed typical SSCs growth characteristics. The results of immunofluorescence showed that the glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) family receptor 偽 1 (GFR 偽 1) and VASA protein were highly expressed in the cell spheres. CD44, a CSCs marker, was expressed in the cells and the inner cells of the spheres of As,Apr,Aal at all stages, but almost not in the somatic cells. Conclusion the isolation and in vitro culture system of SSCs from DBA/2 mice were established. CD44 was expressed strongly in spermatogonial cells at the early stage of development.
【作者單位】： 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室;
【基金】：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(IMBF201006)~~
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2413130