【摘要】：第一部分 海藻施萬菌適應(yīng)高鹽環(huán)境的轉(zhuǎn)錄組變化分析海藻施萬菌是一種可以產(chǎn)河豚毒素的、在水環(huán)境中生存的細(xì)菌,可能會(huì)引起椎間盤炎、血性腹瀉等,能夠在多種環(huán)境下生存,從腐爛的食物、感染的動(dòng)物、病人的血液和拭子標(biāo)本、淡水湖、深海中都可以分離到施萬菌。海藻施萬菌是一種耐高鹽環(huán)境的細(xì)菌,本研究對(duì)海藻施萬菌進(jìn)入高鹽環(huán)境下不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序,分析其差異,并對(duì)可能涉及的相關(guān)的耐鹽基因進(jìn)行了分析。在本研究中,共確定了1808個(gè)轉(zhuǎn)錄差異基因,占海藻施萬菌總基因數(shù)的41.5%(1808/4354)。其中大約40.3%的差異基因?qū)儆诩傧氲鞍?包括未知功能的基因。有20.9%的差異基因?qū)儆诙喾N代謝相關(guān)的基因,包括碳源代謝、氨基酸代謝等。另外一些膜轉(zhuǎn)運(yùn)體、細(xì)胞動(dòng)力基因、DNA復(fù)制和修復(fù)系統(tǒng)以及信號(hào)傳遞系統(tǒng)等基因轉(zhuǎn)錄水平改變明顯。細(xì)菌進(jìn)入高鹽環(huán)境下一個(gè)重要的反應(yīng)是排出鈉離子,攝入鉀離子,并且通過從外界轉(zhuǎn)運(yùn)外源谷氨酸和自身合成谷氨酸來中和陽離子蓄積帶來的正電荷等,從轉(zhuǎn)錄組分析上,顯示海藻施萬菌也表現(xiàn)出類似的反應(yīng)。另外,還發(fā)現(xiàn)海藻施萬菌中,肽聚糖合成以及DNA合成修復(fù)相關(guān)基因、核糖體大小亞基等基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)明顯。能量代謝方面,三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶在1h時(shí)轉(zhuǎn)錄下調(diào),而在4h或14h時(shí)回升到原來水平或上調(diào)。厭氧呼吸中的關(guān)鍵酶在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)都升高明顯。通過本研究,我們對(duì)海藻施萬菌應(yīng)對(duì)高鹽壓力的機(jī)制做了一個(gè)時(shí)序性的動(dòng)態(tài)分析,明確了海藻施萬菌在進(jìn)入高鹽環(huán)境后啟動(dòng)的應(yīng)對(duì)高鹽壓力的多種途徑。第二部分霍亂弧菌外膜蛋白OmpW轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)以抵抗高鹽環(huán)境霍亂弧菌是一種能引起嚴(yán)重腹瀉的腸道致病菌,其生存中需要克服不同環(huán)境壓力包括海水和食物中的高鹽壓力。為分析霍亂弧菌適應(yīng)高鹽環(huán)境基因轉(zhuǎn)錄變化,根據(jù)在其他細(xì)菌中研究的耐鹽相關(guān)基因,我們挑選了Sigma因子、Na/K離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道、谷氨酸合成基因、肽聚糖合成基因等可能的高鹽相關(guān)基因,利用real-time PCR array的方法對(duì)分離自不同時(shí)間和地點(diǎn)的4株01群和4株0139群霍亂弧菌在高鹽條件下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究。這8株霍亂弧菌的耐鹽程度介于4%-6%之間,O1群和0139群的耐鹽程度沒有明顯差異。Real-time PCR array的結(jié)果顯示,霍亂弧菌在抵抗高鹽環(huán)境時(shí)的一些基本機(jī)制同其他細(xì)菌相類似,8株菌中都有K離子攝入基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),Na離子攝入基因轉(zhuǎn)錄下調(diào),谷氨酸合成基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)等。其中有3個(gè)Sigma因子(regulator of sigma D、RNA polymerase sigma-70 factor, ECF subfamily和Sigma-54 modulation protein)在8株菌中的轉(zhuǎn)錄水平幾乎都上調(diào),說明這三個(gè)Sigma因子對(duì)霍亂弧菌應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境具有重要的意義。重要的是,這8株菌具有菌株特異性的現(xiàn)象。Sigma因子和肽聚糖合成基因在不同的菌株中轉(zhuǎn)錄水平改變不同。通過HCL聚類分析發(fā)現(xiàn),基因轉(zhuǎn)錄水平的改變同霍亂弧菌的耐鹽程度相關(guān),如在高耐鹽組中,RpoS. RpoH和RpoN等Sigma因子的基因轉(zhuǎn)錄水平升高,而低耐鹽組中轉(zhuǎn)錄水平不變或降低。我們推測(cè)對(duì)霍亂弧菌來說,除了招募共同的Sigma因子外,高耐鹽組的菌株可能會(huì)招募更多的Sigma因子來啟動(dòng)高鹽應(yīng)激反應(yīng)。另外霍亂弧菌的這種菌株特異性現(xiàn)象,提示在研究細(xì)菌的耐鹽機(jī)制時(shí)應(yīng)該挑選多個(gè)菌株來進(jìn)行分析,尋找共有機(jī)制。針對(duì)一些細(xì)菌的研究,顯示外膜蛋白OmpW可以提高菌株的耐鹽能力。另有些研究顯示OmpW可以轉(zhuǎn)運(yùn)一些物質(zhì),例如鼠傷寒沙門菌(Salmonellaenteric serovar Typhimurium) OmpW同一種除草劑甲基紫精(一種季銨類化合物)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。耐鹽相關(guān)的相容性溶質(zhì)很多也是四價(jià)陽離子化合物,如甜菜堿、膽堿、肉堿以及氨基酸類的如甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、脯氨酸等,在細(xì)菌應(yīng)對(duì)滲透壓時(shí)起了重要的作用。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)在高鹽濃度下,ompW基因轉(zhuǎn)錄也上調(diào)。我們對(duì)霍亂弧菌OmpW是否與耐鹽相關(guān)也進(jìn)行了研究。對(duì)研究的O1群E1 Tor型流行菌株進(jìn)行了ompW基因缺失,發(fā)現(xiàn)缺失ompW基因后,菌株耐鹽能力降低；另外,曾在四川流行過的ompW基因天然缺失菌株(噬菌體生物分型為6b)也納入本研究,對(duì)其進(jìn)行了ompW基因回補(bǔ),發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)完整的ompW基因后,絕大多數(shù)菌株的耐鹽能力升高,說明ompW基因同霍亂弧菌的耐鹽能力相關(guān),可以提高霍亂弧菌的耐鹽能力。在M9培養(yǎng)基中加入甜菜堿、賴氨酸、肉堿后霍亂弧菌的耐鹽能力升高,加入其它相容性溶質(zhì)則未見耐鹽能力的提高,說明霍亂弧菌可能主要以這三種物質(zhì)作為相容性溶質(zhì)來抵抗高鹽壓力。加入相容性溶質(zhì)肉堿后,霍亂弧菌野生株耐鹽能力升高,而其ompW缺失株耐鹽能力不變,提示OmpW同相容性溶質(zhì)肉堿的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。因此,通過本研究,我們獲得了霍亂弧菌適應(yīng)高鹽環(huán)境的耐鹽相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化,并且發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌外膜蛋白OmpW可通過轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)肉堿來提高霍亂弧菌的耐鹽能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378

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