【摘要】：第一部分 海藻施萬菌適應高鹽環(huán)境的轉錄組變化分析海藻施萬菌是一種可以產河豚毒素的、在水環(huán)境中生存的細菌,可能會引起椎間盤炎、血性腹瀉等,能夠在多種環(huán)境下生存,從腐爛的食物、感染的動物、病人的血液和拭子標本、淡水湖、深海中都可以分離到施萬菌。海藻施萬菌是一種耐高鹽環(huán)境的細菌,本研究對海藻施萬菌進入高鹽環(huán)境下不同時間點的轉錄組進行了測序,分析其差異,并對可能涉及的相關的耐鹽基因進行了分析。在本研究中,共確定了1808個轉錄差異基因,占海藻施萬菌總基因數(shù)的41.5%(1808/4354)。其中大約40.3%的差異基因屬于假想蛋白,包括未知功能的基因。有20.9%的差異基因屬于多種代謝相關的基因,包括碳源代謝、氨基酸代謝等。另外一些膜轉運體、細胞動力基因、DNA復制和修復系統(tǒng)以及信號傳遞系統(tǒng)等基因轉錄水平改變明顯。細菌進入高鹽環(huán)境下一個重要的反應是排出鈉離子,攝入鉀離子,并且通過從外界轉運外源谷氨酸和自身合成谷氨酸來中和陽離子蓄積帶來的正電荷等,從轉錄組分析上,顯示海藻施萬菌也表現(xiàn)出類似的反應。另外,還發(fā)現(xiàn)海藻施萬菌中,肽聚糖合成以及DNA合成修復相關基因、核糖體大小亞基等基因轉錄上調明顯。能量代謝方面,三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的關鍵酶在1h時轉錄下調,而在4h或14h時回升到原來水平或上調。厭氧呼吸中的關鍵酶在三個時間點都升高明顯。通過本研究,我們對海藻施萬菌應對高鹽壓力的機制做了一個時序性的動態(tài)分析,明確了海藻施萬菌在進入高鹽環(huán)境后啟動的應對高鹽壓力的多種途徑。第二部分霍亂弧菌外膜蛋白OmpW轉運相容性溶質以抵抗高鹽環(huán)境霍亂弧菌是一種能引起嚴重腹瀉的腸道致病菌,其生存中需要克服不同環(huán)境壓力包括海水和食物中的高鹽壓力。為分析霍亂弧菌適應高鹽環(huán)境基因轉錄變化,根據(jù)在其他細菌中研究的耐鹽相關基因,我們挑選了Sigma因子、Na/K離子轉運通道、谷氨酸合成基因、肽聚糖合成基因等可能的高鹽相關基因,利用real-time PCR array的方法對分離自不同時間和地點的4株01群和4株0139群霍亂弧菌在高鹽條件下的轉錄水平進行了研究。這8株霍亂弧菌的耐鹽程度介于4%-6%之間,O1群和0139群的耐鹽程度沒有明顯差異。Real-time PCR array的結果顯示,霍亂弧菌在抵抗高鹽環(huán)境時的一些基本機制同其他細菌相類似,8株菌中都有K離子攝入基因轉錄上調,Na離子攝入基因轉錄下調,谷氨酸合成基因轉錄上調等。其中有3個Sigma因子(regulator of sigma D、RNA polymerase sigma-70 factor, ECF subfamily和Sigma-54 modulation protein)在8株菌中的轉錄水平幾乎都上調,說明這三個Sigma因子對霍亂弧菌應對高鹽環(huán)境具有重要的意義。重要的是,這8株菌具有菌株特異性的現(xiàn)象。Sigma因子和肽聚糖合成基因在不同的菌株中轉錄水平改變不同。通過HCL聚類分析發(fā)現(xiàn),基因轉錄水平的改變同霍亂弧菌的耐鹽程度相關,如在高耐鹽組中,RpoS. RpoH和RpoN等Sigma因子的基因轉錄水平升高,而低耐鹽組中轉錄水平不變或降低。我們推測對霍亂弧菌來說,除了招募共同的Sigma因子外,高耐鹽組的菌株可能會招募更多的Sigma因子來啟動高鹽應激反應。另外霍亂弧菌的這種菌株特異性現(xiàn)象,提示在研究細菌的耐鹽機制時應該挑選多個菌株來進行分析,尋找共有機制。針對一些細菌的研究,顯示外膜蛋白OmpW可以提高菌株的耐鹽能力。另有些研究顯示OmpW可以轉運一些物質,例如鼠傷寒沙門菌(Salmonellaenteric serovar Typhimurium) OmpW同一種除草劑甲基紫精(一種季銨類化合物)的轉運有關。耐鹽相關的相容性溶質很多也是四價陽離子化合物,如甜菜堿、膽堿、肉堿以及氨基酸類的如甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、脯氨酸等,在細菌應對滲透壓時起了重要的作用。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)在高鹽濃度下,ompW基因轉錄也上調。我們對霍亂弧菌OmpW是否與耐鹽相關也進行了研究。對研究的O1群E1 Tor型流行菌株進行了ompW基因缺失,發(fā)現(xiàn)缺失ompW基因后,菌株耐鹽能力降低；另外,曾在四川流行過的ompW基因天然缺失菌株(噬菌體生物分型為6b)也納入本研究,對其進行了ompW基因回補,發(fā)現(xiàn)回補完整的ompW基因后,絕大多數(shù)菌株的耐鹽能力升高,說明ompW基因同霍亂弧菌的耐鹽能力相關,可以提高霍亂弧菌的耐鹽能力。在M9培養(yǎng)基中加入甜菜堿、賴氨酸、肉堿后霍亂弧菌的耐鹽能力升高,加入其它相容性溶質則未見耐鹽能力的提高,說明霍亂弧菌可能主要以這三種物質作為相容性溶質來抵抗高鹽壓力。加入相容性溶質肉堿后,霍亂弧菌野生株耐鹽能力升高,而其ompW缺失株耐鹽能力不變,提示OmpW同相容性溶質肉堿的轉運相關。因此,通過本研究,我們獲得了霍亂弧菌適應高鹽環(huán)境的耐鹽相關基因的轉錄變化,并且發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌外膜蛋白OmpW可通過轉運相容性溶質肉堿來提高霍亂弧菌的耐鹽能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378

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本文編號：2408790