【摘要】：本研究旨在制備具有功能活性的重組人血小板表面CD36抗原的鼠抗人單克隆抗體。提取人肝細胞總RNA,經RT-PCR擴增編碼人血小板CD36抗原胞外區(qū)(Gly30-Asn439)氨基酸殘基cDNA,構建于原核表達載體pMD18并轉化大腸桿菌DH5α,篩選獲得陽性重組子pMD18-CD36,提取質粒。經序列測定后,將該基因插入到真核細胞瞬時表達載體pTE2上,構建成為pTE2-s-CD36-10 His真核瞬時表達載體。采用lipofectamine 2000轉染法,將重組質粒轉染至HEK293細胞,表達產物經Ni2+2NTA柱層析純化。以制備的重組CD36蛋白免疫BALB/c小鼠后,取脾與小鼠骨髓瘤細胞融合,篩選出陽性克隆,行Western blot檢測抗體結合活性。結果顯示:RT-PCR擴增獲得了1.4 kb的片段。經測序,該序列分析結果與GenBank中的NM_001001547.2完全一致。SDS-PAGE證實轉染的HEK293細胞表達了人CD36抗原胞外區(qū)蛋白片段。鼠單克隆抗體在Western blot中可以識別重組CD36蛋白,靈敏度達到8 ng。結論:成功制備了抗人血小板CD36單克隆抗體,為臨床篩選CD36陰性患者及獻血員、深入研究人血小板CD36表面抗原對血小板輸注無效的影響提供了實驗基礎。
[Abstract]:The aim of this study was to prepare murine anti-human monoclonal antibodies against CD36 antigen on the surface of recombinant human platelets with functional activity. The total RNA, extracted from human hepatocytes was amplified by RT-PCR and encoded by the amino acid cDNA, encoding the extracellular domain of human platelet CD36 antigen (Gly30-Asn439). The cDNA, was constructed into the prokaryotic expression vector pMD18 and transformed into Escherichia coli DH5 偽, and the pMD18-CD36, extraction plasmid of the positive recombinant plasmid was obtained. After sequencing, the gene was inserted into eukaryotic cell transient expression vector pTE2 and constructed as pTE2-s-CD36-10 His eukaryotic transient expression vector. The recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by lipofectamine 2000 transfection, and the expressed product was purified by Ni2 2NTA column chromatography. After immunizing BALB/c mice with recombinant CD36 protein, the spleen was fused with mouse myeloma cells, and the positive clones were screened out. The antibody binding activity was detected by Western blot. The results showed that 1. 4 kb fragment was obtained by RT-PCR amplification. The sequence analysis was consistent with the NM_001001547.2 in GenBank. SDS-PAGE confirmed that the transfected HEK293 cells expressed the extracellular domain protein fragment of human CD36 antigen. Mouse monoclonal antibody can recognize recombinant CD36 protein in Western blot, and its sensitivity is up to 8 ng.. Conclusion: monoclonal antibodies against human platelet CD36 were successfully prepared, which provided experimental basis for clinical screening of CD36 negative patients and blood donors and further study of the effect of human platelet CD36 surface antigen on platelet transfusion.
【作者單位】： 解放軍總醫(yī)院輸血科 解放軍臨床輸血中心;北京義翹神州生物技術有限公司;
【基金】：國家衛(wèi)生部課題,編號201002005
【分類號】：R331.143

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本文編號：2408308