發(fā)布時(shí)間：2018-12-13 13:07

【摘要】：支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是早產(chǎn)兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病,其典型的病理改變?yōu)闅獾澜Y(jié)構(gòu)異常和肺泡發(fā)育不良,具體表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞分化異常,肺泡數(shù)量減少,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡問質(zhì)增生等結(jié)構(gòu)功能的改變。BPD的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚,目前發(fā)現(xiàn)的可能的致病因素包括：早產(chǎn)、子宮內(nèi)環(huán)境、氧氣治療和機(jī)械通氣,感染與炎癥等因素。除了以上外在因素外,遺傳因素異常在BPD的發(fā)生過程也有重要意義,但是目前對BPD模型的表觀遺傳學(xué)的研究較少,本研究將從發(fā)育生物學(xué)的角度來探究表觀遺傳學(xué)因素在BPD發(fā)生過程中的的作用機(jī)制。表觀遺傳學(xué)是研究沒有DNA序列變化的,但可遺傳的基因表達(dá)的改變。組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)研究的一個(gè)重要方向,包括乙�；�,甲基化,磷酸化以及核糖基化等。調(diào)控組蛋白乙�；腿ヒ阴；氖且粚δ芟嗷マ卓沟牡鞍酌�,其中乙�；山M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Histone acelyltransferase, HAT)催化完成,去乙�；瘎t由組蛋白去乙酰化酶(Histone deacelylase, HDAC)介導(dǎo)。目前的研究發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的HDACs總計(jì)18種,按照其結(jié)構(gòu)和功能分為4組,分別為Ⅰ型,Ⅱa型,Ⅱb型和Ⅳ型。Ⅰ型HDACs家族包含四個(gè)成員,分別是HDAC1,HDAC2, HDAC3和HDAC8。HDACs被證明在促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制凋亡過程中發(fā)揮重要作用。除此之外,隨著近年來小鼠同源重組和基因敲除技術(shù)的進(jìn)步,人們發(fā)現(xiàn)HDACs在多種器官的發(fā)育過程中也發(fā)揮不同的組織特異性功能。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型HDACs(HDAC1、HDAC 2和HDAC 3)在整個(gè)小鼠胚胎發(fā)育過程中在肺內(nèi)廣泛、持續(xù)表達(dá),提示其在肺器官發(fā)育過程中中可能發(fā)揮重要作用。在肺上皮細(xì)胞內(nèi)組織特異性敲除HDAC1和HDAC2基因,會導(dǎo)致肺的近端氣道(proximal airway)發(fā)育不良。同樣,在肺上皮細(xì)胞中敲除HDAC3基因,會抑制在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(AT1)在肺發(fā)育晚期肺泡形成階段的重塑功能,導(dǎo)致AT1擴(kuò)張障礙和肺泡塌陷。除了肺上皮細(xì)胞內(nèi),HDAC3在整個(gè)胚胎發(fā)育階段同時(shí)也肺間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá),在本研究中,我們構(gòu)建HDAC3組織特異性敲除小鼠模型來探明肺間質(zhì)細(xì)胞中HDAC3缺失導(dǎo)致小鼠肺發(fā)育不全的作用機(jī)制。第一部分：HDAC3基因缺失導(dǎo)致小鼠肺發(fā)育不良為了研究為了研究HDAC3基因在小鼠胚胎肺發(fā)育中的重要作用,我們首先要明確在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期HDAC3基因在小鼠肺內(nèi)的表達(dá)模式。我們對胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的肺組織切片進(jìn)行HDAC3免疫熒光染色,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯在肺發(fā)育的整個(gè)過程中,HDAC3在肺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中持續(xù)而廣泛的表達(dá),我們可以推測HDAC3在小鼠肺發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要的作用。為了進(jìn)一步研究肺間質(zhì)細(xì)胞中HDAC3基因在肺發(fā)育過程中的作用機(jī)制,我們利用Cre-loxP系統(tǒng)組織特異性敲除目的基因。我們在HDAC3基因4-7號外顯子兩端分別插入一個(gè)LoxP位點(diǎn),在Cre酶作用下將HDAC3基因的4-7號外顯子將被切除。Dermo1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是間質(zhì)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)基因小鼠,該小鼠的Cre重組酶活性由間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Dermo1基因的啟動(dòng)子調(diào)控,可達(dá)到在間質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的目的。我們將HDAC3flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠與Dermo1-Cre+/-轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,獲得HDAC3flox/+;Dermo1Cre+/-基因型小鼠后代,后者再次與HDAC3flox/flox小鼠雜交后可獲得敲除兩個(gè)HDAC3基因的純合體。(HDAC3flox/flox;Dermo1 Cre+/-基因型,又記作HDAC3Dermo1CreKO)分別于小鼠胚胎發(fā)育的不同時(shí)期解剖小鼠取胚胎肺,對其進(jìn)行基因組鑒定,部分肺葉組織固定包埋切片,用于HE染色和免疫熒光染色。部分肺組織加入細(xì)胞裂解液提取總RNA,用于Q-PCR分析實(shí)驗(yàn)。我們通過免疫熒光染色來檢測Dermo1-Cre重組酶的效率,發(fā)現(xiàn)在肺間質(zhì)細(xì)胞中幾未檢測出HDAC3蛋白,提示雜交小鼠在Cre重組酶的作用下有效敲除了在肺間質(zhì)細(xì)胞中的HDAC3基因。95%以上的HDAC3Dermo1CreKO基因型的新生小鼠在出生后幾小時(shí)內(nèi)因呼吸窘迫死亡。組織學(xué)分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HDAC3Dermo1CreKO基因型的小鼠胚胎肺較野生型(WT)對照組略減小,但肺葉數(shù)量和位置未見異常,肺葉邊緣不規(guī)整,提示存在肺間質(zhì)發(fā)育不良。高倍鏡視野下可見氣道分枝化形態(tài)發(fā)生正常,提示HDAC3不是氣道分枝化形態(tài)發(fā)生的必要因素。E18.5肺組織切片的HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠的肺泡數(shù)量減少,部分肺泡塌陷,肺間隔顯著增厚,肺擴(kuò)張存在明顯障礙。肺泡發(fā)育畸形導(dǎo)致無法形成有效的氣體交換平面以建立正常的呼吸功能,是新生小鼠致死的主要原因。。綜上所述,肺間質(zhì)細(xì)胞中HDAC3的重要作用可能貫穿整個(gè)小鼠胚胎肺發(fā)育過程,早期HDAC3基因缺失導(dǎo)致肺間質(zhì)發(fā)育不良,但是不會影響肺上皮細(xì)胞的分枝化形態(tài)發(fā)生過程。在胚胎發(fā)育的晚期原始肺泡發(fā)育階段,HDAC3基因缺失會導(dǎo)致遠(yuǎn)端氣道的發(fā)育缺陷。HDAC3具體以何種機(jī)制參與到肺泡晚期遠(yuǎn)端氣道的組織分化調(diào)控,是我們下一步的研究重點(diǎn)。第二部分：HDAC3在小鼠肺間質(zhì)細(xì)胞增殖和分化過程中的作用第一部分的組織學(xué)分析結(jié)果顯示,HDAC3DermolCreKO基因型小鼠胎肺較野生型(WT)明顯減小,由此我們推測肺間質(zhì)細(xì)胞HDAC3基因缺失導(dǎo)致的肺發(fā)育不良可能是由于肺上皮細(xì)胞或者肺間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力下降所引起的。為了評估HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺發(fā)育過程中肺內(nèi)細(xì)胞增殖是否受到抑制,我們對胚胎發(fā)育不同時(shí)期的肺組織切片行PO4-H3免疫熒光染色和TTF-1、BrdU雙重染色以檢測細(xì)胞增殖率,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)PO4-H3和TTF-1-BrdU+細(xì)胞比例與對照組(WT)相比明顯減少,TTF-1+BrdU+細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比無明顯變化,說明腫間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HDAC3缺失直接影響肺間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力,但是肺上皮細(xì)胞的增殖未受到影響。眾所周知,HDACs會通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),主要通過細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)的正向調(diào)控和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(CKIs)的負(fù)向調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。我們對HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺組織內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞周期相關(guān)因子進(jìn)行Q-PCR分析發(fā)現(xiàn),在肺間質(zhì)細(xì)胞HDAC3基因缺失的小鼠肺組織內(nèi),細(xì)胞周期蛋白CyclinA2、CyclinB1、 CyclinD1和CDK1的mRNA表達(dá)水平顯著下降；P27的mRNA表達(dá)較對照組顯著升高,其他相關(guān)細(xì)胞周期蛋白和激酶無明顯變化。這個(gè)結(jié)果與早前研究報(bào)道相一致,提示HDAC3是通過細(xì)胞周期相關(guān)因子來參與調(diào)控細(xì)胞周期以達(dá)到控制細(xì)胞生長的目的,而其中的具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全清楚,可能是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程。在肺發(fā)育的過程中,肺間質(zhì)細(xì)胞會發(fā)育分化成多種細(xì)胞系,如平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells)、內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells)、周細(xì)胞(pericytes)和間質(zhì)成纖維細(xì)胞(interstitial fibroblasts)。為了研究HDAC3對肺中胚層來源的細(xì)胞系分化的影響,我們對轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織切片行特異性細(xì)胞標(biāo)志物免疫熒光染色。1.小鼠肺組織切片行Sox2和SM22雙重免疫熒光染色,結(jié)果顯示HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠氣道平滑肌未見異常,提示肺間質(zhì)細(xì)胞特異性敲除HDAC3未影響間質(zhì)細(xì)胞源性平滑肌細(xì)胞的分化。2.內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白Pecam表達(dá)在HDAC3基因缺失的肺組織內(nèi)未見異常,Q-PCR結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平相-致,說明HDAC3未參與肺內(nèi)皮細(xì)胞分化的調(diào)控。3. 間質(zhì)成纖維細(xì)胞幾個(gè)重要標(biāo)志物Pdgfr-b和Vmentin的蛋白和mRNA表達(dá)在HDAC3基因缺失的小鼠肺組織中顯著降低。HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型對照小鼠的肺組織中分離的肺間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),免疫熒光染色結(jié)果顯示Ki67+和Pdgfr-b+細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比明顯降低,提示肺間質(zhì)細(xì)胞特異性敲除HDAC3影響肺間質(zhì)來源的成纖維細(xì)胞的增殖和分化。第三部分HDAC3在小鼠肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞分化過程中作用機(jī)制的研究小鼠胚胎發(fā)育至E17.5,肺的發(fā)育由氣道分枝化形態(tài)發(fā)生階段進(jìn)入原始肺泡形成階段。這個(gè)階段包含遠(yuǎn)端氣道末端擴(kuò)張呈囊和肺泡上皮細(xì)胞分化兩個(gè)主要的發(fā)育過程。為了研究肺間質(zhì)細(xì)胞HDAC3基因缺失是否影響肺上皮細(xì)胞的分化,我們采用組織切片免疫熒光染色和Q-PCR分析來檢測肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)志物的蛋白和mRNA表達(dá)：1.肺泡1型上皮細(xì)胞(AEC 1)的細(xì)胞標(biāo)志物AQP-5和T1-alpha的蛋白和mRNA表達(dá)在HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中明顯減低,提示AEC 1細(xì)胞分化障礙。2.肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AEC 2)的細(xì)胞特異性標(biāo)志物Sftpc、Sftpb和Abca在HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織的表達(dá)未見明顯異常,說明肺間質(zhì)細(xì)胞特異性敲除HDAC3未影響AEC 2細(xì)胞的分化和成熟。3.纖毛上皮細(xì)胞特異性細(xì)胞標(biāo)志物Foxj1和beta-tublin Ⅳ,分泌細(xì)胞標(biāo)志物Scbg1a1,HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中這些近端氣道的上皮細(xì)胞的標(biāo)志物的表達(dá)與對照組相比(WT)無明顯差異,提示HDAC3基因不參與肺近端氣道上皮細(xì)胞的分化和發(fā)育的調(diào)控。為了研究肺間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HDAC3缺失導(dǎo)致肺泡擴(kuò)張障礙和AEC 1細(xì)胞分化不全的的分子機(jī)制,我們采用磁珠分選的方法分離肺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞,并對其進(jìn)行Q-PCR分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HDAC3缺失的EpCAM-的肺間質(zhì)細(xì)胞中配體Wnt2和Wnt5的表達(dá)明顯下降；EpCAM+的肺上皮細(xì)胞中配體Wnt5a和Wnt7a表達(dá)同樣受到抑制,經(jīng)典Wnt信號通路中常見的目的基因Axin2、Lef-1和CyclinD1的表達(dá)明顯減低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)肺間質(zhì)細(xì)胞特異性敲除HDAC3會抑制Wnt信號通路配體的表達(dá),進(jìn)一步導(dǎo)致經(jīng)典Wnt/p-catenin信號通路的活性下降。HDAC3在胚胎肺發(fā)育晚期的肺泡擴(kuò)張和AEC1分化成熟的過程發(fā)揮重要作用,體外肺組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在胚胎肺發(fā)育晚期抑制Wnt/β-catenin信號通路活性可以造成肺發(fā)育晚期AEC1分化缺陷,同時(shí)挽救實(shí)驗(yàn)中在胚胎發(fā)育晚期給孕鼠腹腔注射Wnt信號通路激動(dòng)劑LiCI可以緩解肺間質(zhì)細(xì)胞HDAC3缺失導(dǎo)致的肺發(fā)育不良。由此我們可以得出結(jié)論,肺間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的HDAC3對肺發(fā)育晚期AEC1的分化成熟具有重要意義,HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因的小鼠的肺內(nèi)AEC1的分化缺陷是由于肺上皮細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路活性減低所引起的,而HDAC3作為上游的調(diào)控因子對Wnt/β-catenin信號通路活性發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R321

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本文編號：2376582