【摘要】：G72是具有153個氨基酸的靈長類特有蛋白質(zhì),多項(xiàng)研究指出G72具有與DAO (D-amino acid oxidase)交互作用的特性,而且這些交互作用與精神分裂癥、重郁癥及其他精神疾病具有高度相關(guān)。DAO是一代謝D型氨基酸的酶,需要黃素做為其輔基,主要功能在于調(diào)控突觸間神經(jīng)傳遞物質(zhì)D-serine的濃度。D-serine 為N-methyl-D-aspartate (NMDA)受體的配體,NMDA受體的過活或低活可能與神經(jīng)或精神疾病的發(fā)生相關(guān)。因此本論文將證明G72可能經(jīng)由抑制DAO的酶活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)突觸間D-serine的濃度。在此研究中,我們分別制備了pMAL-C2G-DAO、 pGEX-6p-1-G72、pET23a-DAO及pET23a-G72蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒。初步的活性測試發(fā)現(xiàn)MBP tag的體積太大,嚴(yán)重的影響了DAO的活性,而GST-G72蛋白有斷裂現(xiàn)象,因此我們以DAO-6H及重新折迭(re-folding)后的G72-6H為本論文的主要探討對象。為了探討G72第30個氨基酸突變后的活性,本實(shí)驗(yàn)以單點(diǎn)突變技術(shù)將G72的第30個氨基酸Arginine突變?yōu)閹д姷腖ysine、帶負(fù)電的Glutamate以及不帶電的Alanine。接著,我們探討G72-6H和G72R30A-6H、G72R30D-6H及G72R30K-6H與調(diào)控DAO活性的差異,我們利用D-proline為受質(zhì),以不同DAO:G72之濃度比測試加入各種G72-6H后DAO的活性變化。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著G72-6H濃度比例的增加,G72-6H顯著的抑制DAO活性。G72R30A-6H、G72R30K-6H在1：16的比例下亦可抑制22.14%和13.18%的DAO活性,而G72R30D-6H卻無顯著的抑制現(xiàn)象。本研究體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明了G72的第30個氨基酸可能扮演與DAO結(jié)合的角色并經(jīng)由交互作用抑制DAO的酶活性。此機(jī)制可使腦中神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)D-serine的濃度降低。這個結(jié)果也許可以說明部分研究報告所指出的G72R30K(rs2391191)于精神疾病中占有較高的比例。進(jìn)一步利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行篩查,尋找G72過表達(dá)引起的氧化應(yīng)激改變。基因芯片技術(shù)篩查獲得了有意義的陽性結(jié)果,說明G72對氧化應(yīng)激具有影響作用。G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對照組之間的差異,主要表現(xiàn)為抗氧化應(yīng)激基因表達(dá)上調(diào)。這種抗氧化基因表達(dá)上調(diào)有可能是G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞對增高的ROS水平的一種適應(yīng)性代償。本研究發(fā)現(xiàn)G72蛋白會與野生型正常的SOD1蛋白發(fā)生結(jié)合,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株中過表達(dá)G72蛋白會誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS,進(jìn)一步證實(shí)G72參與氧化應(yīng)激調(diào)控。神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株中過表達(dá)G72蛋白會誘導(dǎo)HADHB(線粒體膜蛋白)、P21、P53、STAT1、AMPKr-1、Cytochrom C、P38α、MAPK的表達(dá)量都上升,提示過表達(dá)G72蛋白可能會通過細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期停滯、和細(xì)胞凋亡三種路徑通路傷害細(xì)胞；將G72基因轉(zhuǎn)入ALS模式小鼠(SOD1_G93A)大腦運(yùn)動皮質(zhì)區(qū),發(fā)現(xiàn)小鼠運(yùn)動能力下降、壽命縮短,提示G72蛋白可能會破壞小鼠的神經(jīng)細(xì)胞造成運(yùn)動能力下降。本研究以SOD類似物Tempol處理G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞,以改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài),結(jié)果抗氧化劑的應(yīng)用有效降低了G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ROS水平,這一結(jié)果表明氧化應(yīng)激是G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng),G72通過誘發(fā)ROS,促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生。有研究表明G72載體轉(zhuǎn)染動物后,ROS升高是由于過表達(dá)G72誘發(fā)了氧化應(yīng)激,從而說明G72很可能是誘發(fā)氧化應(yīng)激的重要原因。因此,我們對G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞的氧化應(yīng)激改變進(jìn)行了驗(yàn)證。首先對G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞評價其ROS水平,發(fā)現(xiàn)ROS在G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞中升高明顯,提示存在氧化應(yīng)激狀態(tài)改變。我們還從細(xì)胞清除ROS能力的角度出發(fā),進(jìn)一步分析了抗氧化酶SOD1的活力,G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞SOD活力比空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞有所下降。上述結(jié)果表明,G72轉(zhuǎn)染細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),遭受氧化應(yīng)激損傷,并且抗氧化能力受到一定程度損傷。綜上所述,過表達(dá)的G72會與細(xì)胞質(zhì)中SOD1蛋白形成復(fù)合物,導(dǎo)致SOD1堆積于線粒體,由于SOD1堆積致使蛋白活性下降,無法有效清除超氧化物,使氧化應(yīng)激增高,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞傷害或死亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R3416

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本文編號：2375238