【摘要】：隨著癌癥化學治療藥物的效果不斷提高,癌癥患者的預后也隨之不斷改善。然而,由于化療引起的心肌病變卻成為癌癥患者不良預后的重要因素之一。阿霉素(多柔比星,Doxrubicin)屬于蒽環(huán)類藥物,是目前臨床常用的癌癥化療藥物。然而,阿霉素的使用會造成不可逆性的心肌損傷,最終導致心力衰竭。關于阿霉素致心肌損傷的確切機制相對復雜,近期研究認為,線粒體損傷、氧化應激、鈣超載和細胞遺傳毒性是阿霉素造成心肌損傷的主要機制。心肌損傷的發(fā)展過程是動態(tài)的,具有時間相關性。時序性基因表達分析為研究生命過程提供了時間維度的豐富信息,其中不僅包括靜態(tài)基因表達結果,還能夠表現(xiàn)基因表達的動態(tài)關系。因此,通過時序性基因表達分析,更全面的構建疾病進展的生物網(wǎng)絡,表述致病機制,為藥物研發(fā)和臨床治療提供指導。本研究采用丹參作為研究載體,研究丹參中保護心肌抵抗阿霉素損傷的有效部位和成分及其作用機制,主要內(nèi)容包括以下四個方面:1、阿霉素損傷大鼠心肌時序性基因表達分析本文采用DrugMatrix數(shù)據(jù)庫內(nèi)阿霉素作用大鼠心肌實驗轉(zhuǎn)錄組芯片結果,通過GC穩(wěn)健多芯片平均化(GCRobust Multi-array Average,GCRMA)方法進行芯片背景校正,獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結果。以觀測時間點正常組作為對照,獲得阿霉素作用1天、3天和5天的差異化表達基因,篩選閾值為1.5倍表達倍率,p值小于0.05,三個時間點差異化表達基因共計815個。進一步,采用短時序表達數(shù)據(jù)挖掘(Short Time-series Expression Miner,STEM)工具包進行時間相關的基因表達模式分析,共呈現(xiàn)9種表達模式,對每類基因表達模式進行GO功能富集分析,取各組別中主要作用基因共計196個;采用STRING數(shù)據(jù)庫搜索蛋白-蛋白相互作用,共計563個作用節(jié)點,構建阿霉素損傷大鼠心肌作用機制動態(tài)生物網(wǎng)絡,為接下來分析中藥活性成分作用機制提供了理論基礎。2、阿霉素損傷大鼠H9C2心肌細胞模型建立基于第一部分阿霉素損傷機制分析,通過高內(nèi)涵實時細胞熒光技術建立阿霉素損傷大鼠H9C2心肌細胞模型,獲得多種與細胞健康程度相關參數(shù),包括線粒體損傷、鈣離子超載和遺傳毒性,從多方面同時表現(xiàn)阿霉素造模情況。選取自由基清除劑依達拉奉作為陽性化合物,通過H9C2細胞評價了依達拉奉的心肌毒性量效關系,同時評價了依達拉奉保護H9C2細胞抵抗阿霉素作用的量效關系。結果發(fā)現(xiàn),10 μ依達拉奉能夠抑制阿霉素引起的細胞凋亡和鈣超載現(xiàn)象,但對阿霉素引起的遺傳毒性無明顯作用。為進一步對丹參有效部分和成分發(fā)現(xiàn)奠定了實驗基礎。3、丹參餾分制備及成分含量測定本文以丹參為研究載體,建立了高效液相色譜外標法測定丹參種14種成分,包括丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、金合歡素、丹酚酸D、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、鼠尾草酚、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮、丹參酮ⅡA、齊墩果酸含量方法,并經(jīng)過方法學考察。比較了甲醇提取和20%甲醇-水提取方法,結果表示,甲醇能夠充分獲得丹參成分。通過液相色譜轉(zhuǎn)換方法,將分析液相方法轉(zhuǎn)換至微量制備液相,結合丹參提取物含量測定結果,制備丹參醇提物餾分。對獲得的6個丹參餾分進行含量測定,以丹酚酸B作為指標成分,折算后得到丹酚酸B摩爾濃度為4.02 mmol/L,可用于進一步餾分活性驗證實驗。4、丹參餾分及中藥小分子活性篩選及作用機制解析采用H9C2細胞驗證6個餾分的細胞毒性作用,并采用阿霉素損傷大鼠H9C2心肌細胞模型評價各個餾分保護作用,發(fā)現(xiàn)餾分1和餾分2具有一定的心肌保護活性。選取課題組中藥小分子化合物庫中常見中藥成分76個與丹參中14種指標成分組成備選化合物,采用阿霉素損傷大鼠H9C2心肌細胞模型進行高通量篩選,對獲得的6個細胞活性相關參數(shù)采用主成分-K均值分類模式識別,共獲得8種作用模式,其中丹參中單體化合物與依達拉奉有相似作用的有丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、金合歡素、丹酚酸A、二氫丹參酮�；钚猿煞謫误w主要分布于餾分1和餾分2中,與餾分活性結果相符。進一步分析單體作用機制,基于課題組前期對丹參中小分子化合物藥效靶點預測和數(shù)據(jù)庫整理,提取活性丹參小分子靶點,與第一部分生物網(wǎng)絡中蛋白匹配,發(fā)現(xiàn)主要作用靶點為MMP2、ALOX15、APP、CYP2E1,對主要作用靶點和動態(tài)生物網(wǎng)絡中一級節(jié)點基因進行功能富集分析,發(fā)現(xiàn)丹參發(fā)揮保護心肌作用成分來自極性較大部位,主要機制是通過抑制凋亡過程,減輕缺氧反應。本文以丹參為研究載體,基于時序性基因表達分析結果和細胞學驗證實驗,從單體-餾分層面探討并驗證了丹參保護心肌抑制阿霉素損傷的有效部位和作用機制,為從分子層次和系統(tǒng)層面上揭示中藥復雜成分體系作用機理提供方法學支持。
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【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5;R-332

【參考文獻】

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1 WANG Wei;LIANG You-Sheng;;Artemisinin:A wonder drug from Chinese natural medicines[J];Chinese Journal of Natural Medicines;2016年01期

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本文編號：2374725