【摘要】：目的:利用高通量長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片檢測(cè)不同極化類型人巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA與mRNA表達(dá)譜變化,初步探討lncRNA核富集轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。方法:1.磁珠分選法純化人外周血單核細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)分化為原代人單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞。以20 ng/ml IFN-γ及100 ng/ml LPS刺激巨噬細(xì)胞18 h將其誘導(dǎo)成M1型巨噬細(xì)胞模型,以20 ng/ml IL-4刺激巨噬細(xì)胞18 h將其誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞模型。利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、CCL17和CCL18的濃度;RT-PCR檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CXCL10、CXCL11、Nos2)和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CCL17、CCL18、CCL22)的mRNA表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞CD86和CD206表達(dá),以驗(yàn)證M1、M2細(xì)胞是否誘導(dǎo)成功。2.利用高通量Arraystar human lncRNA芯片比較未極化巨噬細(xì)胞(M0)、M1和M2之間lncRNA和mRNA表達(dá)譜差異。對(duì)差異表達(dá)的mRNA分別進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析。選取6個(gè)差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.以IL-4刺激M1型巨噬細(xì)胞,以IFN-γ及LPS刺激M2型巨噬細(xì)胞,檢測(cè)M1、M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子,驗(yàn)證M1、M2細(xì)胞重極化模型是否誘導(dǎo)成功。采用RT-PCR檢測(cè)lncRNA NEAT1在M1/M2重極化過(guò)程中的表達(dá)變化。4.設(shè)計(jì)并合成針對(duì)NEAT1基因的siRNA及無(wú)關(guān)序列,轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,48 h后,以IFN-γ及LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化,以IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化,采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-12及IL-10的分泌量;RT-PCR檢測(cè)M1、M2巨噬細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)。將NEAT1 siRNA轉(zhuǎn)染M1型巨噬細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)M1極化表型的影響。結(jié)果:1.經(jīng)IFN-γ及LPS刺激的人單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞中CD86高表達(dá),IL-6、IL-12和TNF-α分泌水平明顯增加,CXCL10、CXCL11和Nos2表達(dá)增加,符合M1型巨噬細(xì)胞的特點(diǎn);經(jīng)IL-4處理的人單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞中CD206高表達(dá),IL-10、CCL17和CCL18分泌水平明顯增加,CCL17、CCL18和CCL22表達(dá)增加,符合M2型巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)。2.芯片結(jié)果顯示不同極化類型巨噬細(xì)胞間lncRNA和mRNA表達(dá)差異顯著:在lncRNA中,M1與M0間共9343條lncRNA異常表達(dá);M2與M0間共4592條lncRNA異常表達(dá);M2與M1間共有10480條lncRNA異常表達(dá)。在mRNA中,M1與M0間共5903條lncRNA異常表達(dá);M2與M0間共3122條lncRNA異常表達(dá);M2與M1間共有7062條lncRNA異常表達(dá)。3.GO分析發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中差異表達(dá)的mRNA主要與免疫應(yīng)答、免疫系統(tǒng)進(jìn)程、防御反應(yīng)、固有免疫應(yīng)答、趨化因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞膜等方面有關(guān)聯(lián)。Pathway分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的mRNA參與細(xì)胞因子間相互作用、TNF信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、NK-κB信號(hào)通路、NOD信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、脂肪酸代謝、PPAR信號(hào)通路、癌癥通路等。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。4.當(dāng)體外刺激條件改變時(shí),M1、M2巨噬細(xì)胞均可發(fā)生重極化。RT-PCR結(jié)果顯示,M1型巨噬細(xì)胞的lncRNA NEAT1表達(dá)水平顯著高于未極化細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。M1向M2極化轉(zhuǎn)換過(guò)程中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)逐漸降低;而M2向M1極化轉(zhuǎn)換過(guò)程中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)逐漸升高。5.NEAT1 siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后,經(jīng)IFN-γ及LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞中IL-12分泌降低,CXCL10和CXCL11 mRNA表達(dá)水平下降;而經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞中IL-10分泌增加,CCL17和CCL18 mRNA表達(dá)升高。此外,NEAT1 siRNA轉(zhuǎn)染M1型巨噬細(xì)胞后,M1型巨噬細(xì)胞中IL-12分泌降低,IL-10分泌增加,其特點(diǎn)向M2樣巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換。結(jié)論:1.體外培養(yǎng)條件下,IFN-γ及LPS能夠誘導(dǎo)人單核來(lái)源巨噬細(xì)胞向M1型極化;IL-4能夠誘導(dǎo)人單核來(lái)源巨噬細(xì)胞向M2型極化。2.利用高通量lncRNA芯片篩選了不同極化類型人巨噬細(xì)胞間差異表達(dá)的lncRNA和mRNA。通過(guò)GO、Pathway分析對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行分析,初步分析顯示這些異常表達(dá)mRNA可能在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中發(fā)揮作用。利用RT-PCR對(duì)部分差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證,檢測(cè)結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致,證實(shí)了芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。3.lncRNA NEAT1在M1巨噬細(xì)胞中高表達(dá),參與調(diào)控巨噬細(xì)胞極化,干擾lncRNA NEAT1表達(dá)可有效抑制M1型巨噬細(xì)胞極化,并可誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞重極化為M2型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2370605