【摘要】：目的:利用高通量長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片檢測不同極化類型人巨噬細胞中l(wèi)ncRNA與mRNA表達譜變化,初步探討lncRNA核富集轉錄本1(NEAT1)對巨噬細胞極化的影響。方法:1.磁珠分選法純化人外周血單核細胞,經體外培養(yǎng)分化為原代人單核細胞來源的巨噬細胞。以20 ng/ml IFN-γ及100 ng/ml LPS刺激巨噬細胞18 h將其誘導成M1型巨噬細胞模型,以20 ng/ml IL-4刺激巨噬細胞18 h將其誘導成M2型巨噬細胞模型。利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、CCL17和CCL18的濃度;RT-PCR檢測M1型巨噬細胞標志物(CXCL10、CXCL11、Nos2)和M2型巨噬細胞標志物(CCL17、CCL18、CCL22)的mRNA表達;流式細胞術檢測巨噬細胞CD86和CD206表達,以驗證M1、M2細胞是否誘導成功。2.利用高通量Arraystar human lncRNA芯片比較未極化巨噬細胞(M0)、M1和M2之間lncRNA和mRNA表達譜差異。對差異表達的mRNA分別進行GO分析和KEGG pathway分析。選取6個差異表達lncRNA進行RT-PCR檢測,驗證芯片結果的準確性。3.以IL-4刺激M1型巨噬細胞,以IFN-γ及LPS刺激M2型巨噬細胞,檢測M1、M2型巨噬細胞相關分子,驗證M1、M2細胞重極化模型是否誘導成功。采用RT-PCR檢測lncRNA NEAT1在M1/M2重極化過程中的表達變化。4.設計并合成針對NEAT1基因的siRNA及無關序列,轉染巨噬細胞,48 h后,以IFN-γ及LPS誘導巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化,以IL-4誘導巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化,采用ELISA檢測細胞因子IL-12及IL-10的分泌量;RT-PCR檢測M1、M2巨噬細胞相關分子表達。將NEAT1 siRNA轉染M1型巨噬細胞,檢測其對M1極化表型的影響。結果:1.經IFN-γ及LPS刺激的人單核細胞來源巨噬細胞中CD86高表達,IL-6、IL-12和TNF-α分泌水平明顯增加,CXCL10、CXCL11和Nos2表達增加,符合M1型巨噬細胞的特點;經IL-4處理的人單核細胞來源巨噬細胞中CD206高表達,IL-10、CCL17和CCL18分泌水平明顯增加,CCL17、CCL18和CCL22表達增加,符合M2型巨噬細胞的特點。2.芯片結果顯示不同極化類型巨噬細胞間lncRNA和mRNA表達差異顯著:在lncRNA中,M1與M0間共9343條lncRNA異常表達;M2與M0間共4592條lncRNA異常表達;M2與M1間共有10480條lncRNA異常表達。在mRNA中,M1與M0間共5903條lncRNA異常表達;M2與M0間共3122條lncRNA異常表達;M2與M1間共有7062條lncRNA異常表達。3.GO分析發(fā)現(xiàn)巨噬細胞極化過程中差異表達的mRNA主要與免疫應答、免疫系統(tǒng)進程、防御反應、固有免疫應答、趨化因子活性、細胞因子活性、細胞外間隙、細胞膜等方面有關聯(lián)。Pathway分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達的mRNA參與細胞因子間相互作用、TNF信號通路、趨化因子信號通路、NK-κB信號通路、NOD信號通路、MAPK信號通路、脂肪酸代謝、PPAR信號通路、癌癥通路等。RT-PCR驗證結果與芯片檢測結果一致。4.當體外刺激條件改變時,M1、M2巨噬細胞均可發(fā)生重極化。RT-PCR結果顯示,M1型巨噬細胞的lncRNA NEAT1表達水平顯著高于未極化細胞和M2型巨噬細胞。M1向M2極化轉換過程中l(wèi)ncRNA NEAT1表達逐漸降低;而M2向M1極化轉換過程中l(wèi)ncRNA NEAT1表達逐漸升高。5.NEAT1 siRNA轉染巨噬細胞后,經IFN-γ及LPS誘導的M1型巨噬細胞中IL-12分泌降低,CXCL10和CXCL11 mRNA表達水平下降;而經IL-4誘導的M2巨噬細胞中IL-10分泌增加,CCL17和CCL18 mRNA表達升高。此外,NEAT1 siRNA轉染M1型巨噬細胞后,M1型巨噬細胞中IL-12分泌降低,IL-10分泌增加,其特點向M2樣巨噬細胞轉換。結論:1.體外培養(yǎng)條件下,IFN-γ及LPS能夠誘導人單核來源巨噬細胞向M1型極化;IL-4能夠誘導人單核來源巨噬細胞向M2型極化。2.利用高通量lncRNA芯片篩選了不同極化類型人巨噬細胞間差異表達的lncRNA和mRNA。通過GO、Pathway分析對差異表達的mRNA進行分析,初步分析顯示這些異常表達mRNA可能在巨噬細胞極化過程中發(fā)揮作用。利用RT-PCR對部分差異表達lncRNA進行驗證,檢測結果與芯片檢測結果一致,證實了芯片檢測結果的可靠性。3.lncRNA NEAT1在M1巨噬細胞中高表達,參與調控巨噬細胞極化,干擾lncRNA NEAT1表達可有效抑制M1型巨噬細胞極化,并可誘導M1型巨噬細胞重極化為M2型。
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【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2370605