【摘要】：目的白假絲酵母菌(Candida albicans,原稱白色念珠菌)是人人類常見的條件致病菌,在特定條件下能夠引起機(jī)體體表及深部組織器官的感染。對于人類免疫缺陷病的患者,白假絲酵母菌所致的系統(tǒng)性念珠菌感染會導(dǎo)致高的死亡率。在自然條件下,幾乎所有的微生物實(shí)際上是附著在物體的表面,形成生物膜結(jié)構(gòu)來維持生存的。生物膜是附著在物體表面由胞外基質(zhì)及其內(nèi)的微生物組成。多數(shù)慢性感染與微生物形成的生物膜密切相關(guān)。生物膜內(nèi)的致病微生物往往能夠躲避藥物的作用從而引起機(jī)體致命的系統(tǒng)性感染。同理,白假絲酵母菌生物膜使得白假絲酵母菌菌體免受機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊,同時抵擋了抗菌藥物對菌體的藥理作用,使致病菌不斷釋放進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)從而引發(fā)感染。大多數(shù)抗菌藥物通過作用于微生物的特定靶點(diǎn)來將其消滅(例如阿莫西林等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素)。但是口前抗真菌藥物種類很少,主要有多烯類抗生素(兩性霉素B)等抗真菌藥物。這些藥物通常對機(jī)體有很強(qiáng)的毒副作用,而且隨著藥物濫用導(dǎo)致了耐藥菌株頻繁產(chǎn)生,臨床上控制感染的難度不斷增加。因此,研究生物膜與藥物耐受的關(guān)系,研發(fā)新型抗真菌藥物,一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。通過查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)國外學(xué)者有進(jìn)行化合物及抗生素連用的研究,他們發(fā)現(xiàn)將抗菌藥物與化合物聯(lián)用能夠提高抗抗菌藥物的治療效果并且能夠減少耐藥菌株。這為臨床治療提供了新的思路。因此我們課題組前期的研究便是從國家化合物樣品庫中購入了五萬余個小分子化合物,通過大量篩選,已經(jīng)篩選出了能夠提高兩性霉素B藥效的小分子化合物。進(jìn)一步,針對前期實(shí)驗(yàn)所篩選出來的化合物,我們對其協(xié)同兩性霉素B的抗真菌作用進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。并且在驗(yàn)證其協(xié)同作用的同時,利用新興的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),針對實(shí)驗(yàn)組與對照組在基因水平的差異,試圖探尋加入小分子化合物后在白假絲酵母菌生物膜中表達(dá)差異顯著基因,以這些基因?yàn)橥黄泣c(diǎn),尋找具體協(xié)同作用的生物學(xué)靶點(diǎn)。材料和方法培養(yǎng)白假絲酵母菌3153A菌株,通過高通量篩選51520個小分子化合物后針對提高抑制率最明顯的F0371-0041(3號)、F0760-2126(10號)化合物進(jìn)行復(fù)篩,利用抗生素敏感性檢驗(yàn),活死細(xì)胞染色,細(xì)胞毒性檢測,轉(zhuǎn)錄組測序分析及實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證在體外證實(shí)化合物系統(tǒng)兩性霉素B清除白假絲酵母菌生物膜的能力,在體內(nèi)利用小鼠構(gòu)建系統(tǒng)性念珠菌病模型,分組藥物作用后進(jìn)行組織切片染色,觀察菌絲數(shù)量來驗(yàn)證化合物對于藥物的協(xié)同作用。利用IlluminaHiSeq 4000轉(zhuǎn)錄組測序,我們分別將實(shí)驗(yàn)組與對照組送檢,將所有生物信息比對,分析篩選表達(dá)差異明顯的基因。結(jié)果1.在抗生素敏感性檢驗(yàn)中,3號及10號化合物顯著提高了兩性霉素B對微生物的抑制率2.將對照組及實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行活死細(xì)胞染色后在共聚焦顯微鏡下拍攝觀察,可以直觀的看到相比于對照組,實(shí)驗(yàn)組中的活菌數(shù)量明顯減少3.針對3號及10號化合物的細(xì)胞毒性檢測顯示其在實(shí)驗(yàn)所以濃度下無明顯細(xì)胞毒性4.轉(zhuǎn)錄組測序分析探查出了實(shí)驗(yàn)組及對照組間表達(dá)差異明顯的基因,利用熒光定量PCR驗(yàn)證后得出了較可靠的幾個基因5.體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在系統(tǒng)性念珠菌病小鼠模型中,實(shí)驗(yàn)組與對照組菌絲含量的差異結(jié)論通過高通量篩選,由國家化合物庫購入的51520個化合物中,我們最終篩選確定了 3號及10號小分子化合物,通過一系列的實(shí)驗(yàn),我們驗(yàn)證了相較于對照組,加有小分子化合物的實(shí)驗(yàn)組明顯提高了兩性霉素B對于白假絲酵母菌生物膜的抑制率,為臨床用藥提供了新的策略。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析篩選出的基因是首次發(fā)現(xiàn)與小分子化合物協(xié)同兩性霉素B抗真菌作用相關(guān)的基因。通過這些基因,我們將某些特定的通路與化合物的協(xié)同作用聯(lián)系起來,為后續(xù)進(jìn)一步研究提供了新的思路和方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R378

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本文編號：2344328