【摘要】：目的Stephanthraniline A(STA)是我們課題組前期從中藥黑鰻藤Stephhanotis mucronata中經(jīng)化學(xué)分離和活性篩選發(fā)現(xiàn)的具有較好免疫抑制活性的天然C21甾體化合物。本研究的目的是進(jìn)一步對(duì)STA抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究。方法1.STA體外對(duì)T細(xì)胞活化和增殖的影響:采用Nylon Fiber Column T從小鼠脾細(xì)胞中分離純化T細(xì)胞。以抗CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖,經(jīng)STA作用后,MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖;ELISA和RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞因子的蛋白分泌和mRNA表達(dá);流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布。2.STA體外對(duì)CD4+T細(xì)胞活化和增殖的影響:以Dynabeads從小鼠脾細(xì)胞中分離純化CD4+T細(xì)胞。Concanavalin A(Con A)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化和增殖,經(jīng)STA作用后,流式細(xì)胞儀測(cè)定表面分子CD25和CD69表達(dá)。CFDASE示蹤法測(cè)定CD4+T細(xì)胞增殖指數(shù)。ELISA和Realtime-PCR法測(cè)定細(xì)胞因子的蛋白分泌和mRNA表達(dá)。3.STA抑制T細(xì)胞活化的機(jī)制研究:采用糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)拮抗劑RU486觀察STA的作用是否依賴于GR受體。采用EMSA法測(cè)定STA對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP1、NFKB及NFAT和DNA結(jié)合能力的影響。Western blot法測(cè)定STA對(duì)NFAT1、IKBα、p38、ZAP-70,PKCθ蛋白及其磷酸化的影響。通過觀察Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)/lonomycirn或PMA/抗CD28誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化和增殖確定STA的作用是否依賴于T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)近端信號(hào)和Ca2+信號(hào)。采用計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接方法測(cè)試STA與PKC蛋白(α、βⅡ、ε、η、θ)之間的相互作用。采用ADP-GIo-rM激酶檢測(cè)法觀察STA對(duì)PKCθ活性的影響。采用PKCθ激動(dòng)劑PMA觀察其是否能抑制STA的免疫抑制作用。采用Signal Transduction PathwayFinder PCR觀察STA對(duì)多重信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。4.STA對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠爆發(fā)性肝炎的影響:STA腹腔注射1h后尾靜脈注射Con A誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生爆發(fā)性肝炎。8h后,檢測(cè)小鼠體重變化。收集血清按ELISA法測(cè)定TNF-α,IL-1β、IFN-γ和IL-17的濃度。按ALT和AST檢測(cè)試劑盒說明測(cè)定轉(zhuǎn)氨酶活性。肝臟組織切片后蘇木精-伊紅染色觀察組織病理變化情況。部分切片以FITC-anti-CD4、PE-anti-CD69標(biāo)記免疫熒光染色觀察CD4+CD69+陽性細(xì)胞的數(shù)量。根據(jù)體重、血清中ALT和AST水平及炎癥因子(TNF-α和IL-1β)含量變化和組織病理變化情況評(píng)價(jià)STA對(duì)爆發(fā)性肝炎的治療作用。根據(jù)肝組織CD4+CD69+陽性細(xì)胞數(shù),細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-17)含量評(píng)價(jià)STA體內(nèi)對(duì)CD4+T細(xì)胞在小鼠肝組織內(nèi)活化和聚集的影響。5.STA和Cyclosporine A(CsA)協(xié)同抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的體內(nèi)外研究:采用非有效濃度的STA和CsA聯(lián)合使用觀察它們體外對(duì)Con A誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響。MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖指數(shù)。ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子IL-2的的分泌量。流式細(xì)胞儀測(cè)定CD25的表達(dá)情況。采用二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity,DTH)模型觀察非治療劑量的STA和CsA聯(lián)合使用對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的體內(nèi)作用,以耳廓的腫脹程度和的組織病理變化情況評(píng)價(jià)STA和CsA的協(xié)同作用。最后采用P450-GIoTM CYP3A4篩選系統(tǒng)測(cè)定STA對(duì)CsA代謝酶CYP3A4活性的影響。結(jié)果1.STA體外抑制T細(xì)胞的活化和增殖:STA能顯著抑制抗CD3/CD28誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖,抑制T細(xì)胞進(jìn)入S和G2/M期,抑制細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17的蛋白分泌和mRNA表達(dá)。2.STA體外抑制CD4+T細(xì)胞的活化和增殖:STA能顯著抑制Con A誘導(dǎo)增殖的T細(xì)胞中的CD3+ CD4+T細(xì)胞的比例,但對(duì)CD3+ CD8+ T細(xì)胞的比例沒有明顯的抑制作用;能明顯抑制Con A誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞增殖;抑制表面分子CD25和CD69的表達(dá);抑制細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的蛋白分泌和mRNA表達(dá)。3.STA抑制T細(xì)胞活化的機(jī)制:糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486不能阻斷或減弱STA的作用。STA并不會(huì)擴(kuò)大sub-G1凋亡峰,也不影響抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的mRNA表達(dá)。STA抑制轉(zhuǎn)錄因子AP1、NFKB及NFAT和DNA的結(jié)合能力,抑制NFAT的去磷酸化以及IkB-α和p38的磷酸化。STA對(duì)Zap70的磷酸化沒有明顯的影響,對(duì)PMA/lonomycin或PMA/抗CD28誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化和增殖均具有顯著的抑制作用。STA通過5個(gè)氫鍵結(jié)合于PKCθ的ATP口袋域,STA能抑制PKCθ的活性,抑制CD4+T細(xì)胞內(nèi)的PKCθ磷酸化水平。STA對(duì)Con A誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化和增殖作用不能被PMA逆轉(zhuǎn)。STA能調(diào)節(jié)18條信號(hào)通路中Wnt、Hedgehog、Jak-Stat等10條通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。4.STA緩解Con A誘導(dǎo)的小鼠爆發(fā)性肝炎和CD4+T細(xì)胞在小鼠肝組織內(nèi)活化聚集:STA能明顯恢復(fù)Con A引起的體重降低、緩解血清ALT和AST水平上升和肝組織病變,明顯抑制血清中TNF-α和IL-1β的含量。另外,STA能抑制肝組織中CD4+CD69+T細(xì)胞的數(shù)量,抑制細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生。5.STA和CsA協(xié)同抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答:低濃度的STA和CsA單獨(dú)使用或聯(lián)合使用均不會(huì)對(duì)正常脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。單獨(dú)使用低濃度的STA或CsA不能抑制Con A引起的T細(xì)胞增殖,IL-2產(chǎn)生和CD25表達(dá),但STA和CsA聯(lián)合使用后均具有顯著抑制作用。同樣地,非治療劑量的STA和CsA聯(lián)合口服給藥后能明顯抑制DNFB誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹,減少小鼠耳廓表皮增生和浮腫,以及炎癥細(xì)胞的浸潤。STA能抑制CYP3A4的活性。結(jié)論1.STA體外能抑制T細(xì)胞的激活和增殖,且對(duì)CD4+T細(xì)胞亞型的抑制作用比CD8+T細(xì)胞敏感。2.STA可通過阻止細(xì)胞進(jìn)入分裂周期抑制T細(xì)胞的增殖,但不會(huì)促進(jìn)激活誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡。3.區(qū)別于傳統(tǒng)甾體類抗炎藥物,STA與GR無競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,不依賴于GR起免疫抑制作用。4.區(qū)別于鈣調(diào)蛋白酶抑制劑(calcineurininhibitors,CNls),STA抑制T細(xì)胞激活不是通過TCR近端信號(hào)和Ca2+信號(hào)。5.PKCθ極可能是STA作用的分子靶點(diǎn)。STA可通過氫鍵結(jié)合的方式連接于PKCθ的ATP 口袋域,從而抑制PKCθ的磷酸化和活性,進(jìn)而抑制PKCθ下游NFAT、NFκB和MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞,最終抑制T細(xì)胞的活化。6.STA抑制T細(xì)胞活化和增殖還可能與其調(diào)控多重信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)。7.腹腔注射或口服給予STA在體內(nèi)對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病模型均顯示較好的治療作用。STA通過抑制CD4+T細(xì)胞活化和在肝臟聚集,從而緩解Con A誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝炎。8.STA與CsA可通過互補(bǔ)的分子機(jī)制,或可能提高CsA的體內(nèi)生物利用度,在體內(nèi)外發(fā)揮協(xié)同作用。以上結(jié)果為STA作為用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和自身免疫性疾病的免疫抑制先導(dǎo)化合物的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2341321