【摘要】：目的Stephanthraniline A(STA)是我們課題組前期從中藥黑鰻藤Stephhanotis mucronata中經化學分離和活性篩選發(fā)現(xiàn)的具有較好免疫抑制活性的天然C21甾體化合物。本研究的目的是進一步對STA抑制T細胞免疫反應的作用進行評價,并對其機制進行深入研究。方法1.STA體外對T細胞活化和增殖的影響:采用Nylon Fiber Column T從小鼠脾細胞中分離純化T細胞。以抗CD3/CD28誘導T細胞活化和增殖,經STA作用后,MTT法測定細胞增殖;ELISA和RT-PCR法測定細胞因子的蛋白分泌和mRNA表達;流式細胞儀測定細胞周期分布。2.STA體外對CD4+T細胞活化和增殖的影響:以Dynabeads從小鼠脾細胞中分離純化CD4+T細胞。Concanavalin A(Con A)誘導CD4+T細胞活化和增殖,經STA作用后,流式細胞儀測定表面分子CD25和CD69表達。CFDASE示蹤法測定CD4+T細胞增殖指數(shù)。ELISA和Realtime-PCR法測定細胞因子的蛋白分泌和mRNA表達。3.STA抑制T細胞活化的機制研究:采用糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GR)拮抗劑RU486觀察STA的作用是否依賴于GR受體。采用EMSA法測定STA對轉錄因子AP1、NFKB及NFAT和DNA結合能力的影響。Western blot法測定STA對NFAT1、IKBα、p38、ZAP-70,PKCθ蛋白及其磷酸化的影響。通過觀察Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)/lonomycirn或PMA/抗CD28誘導的T細胞活化和增殖確定STA的作用是否依賴于T細胞受體(T cell receptor,TCR)近端信號和Ca2+信號。采用計算機模擬分子對接方法測試STA與PKC蛋白(α、βⅡ、ε、η、θ)之間的相互作用。采用ADP-GIo-rM激酶檢測法觀察STA對PKCθ活性的影響。采用PKCθ激動劑PMA觀察其是否能抑制STA的免疫抑制作用。采用Signal Transduction PathwayFinder PCR觀察STA對多重信號傳導通路的影響。4.STA對Con A誘導的小鼠爆發(fā)性肝炎的影響:STA腹腔注射1h后尾靜脈注射Con A誘導小鼠產生爆發(fā)性肝炎。8h后,檢測小鼠體重變化。收集血清按ELISA法測定TNF-α,IL-1β、IFN-γ和IL-17的濃度。按ALT和AST檢測試劑盒說明測定轉氨酶活性。肝臟組織切片后蘇木精-伊紅染色觀察組織病理變化情況。部分切片以FITC-anti-CD4、PE-anti-CD69標記免疫熒光染色觀察CD4+CD69+陽性細胞的數(shù)量。根據(jù)體重、血清中ALT和AST水平及炎癥因子(TNF-α和IL-1β)含量變化和組織病理變化情況評價STA對爆發(fā)性肝炎的治療作用。根據(jù)肝組織CD4+CD69+陽性細胞數(shù),細胞因子(IFN-γ和IL-17)含量評價STA體內對CD4+T細胞在小鼠肝組織內活化和聚集的影響。5.STA和Cyclosporine A(CsA)協(xié)同抑制T細胞免疫應答的體內外研究:采用非有效濃度的STA和CsA聯(lián)合使用觀察它們體外對Con A誘導的T細胞免疫應答反應的影響。MTT法測定細胞毒性和細胞增殖指數(shù)。ELISA法測定細胞因子IL-2的的分泌量。流式細胞儀測定CD25的表達情況。采用二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)誘導的小鼠遲發(fā)型超敏反應(delayed-type hypersensitivity,DTH)模型觀察非治療劑量的STA和CsA聯(lián)合使用對T細胞免疫應答的體內作用,以耳廓的腫脹程度和的組織病理變化情況評價STA和CsA的協(xié)同作用。最后采用P450-GIoTM CYP3A4篩選系統(tǒng)測定STA對CsA代謝酶CYP3A4活性的影響。結果1.STA體外抑制T細胞的活化和增殖:STA能顯著抑制抗CD3/CD28誘導的T細胞增殖,抑制T細胞進入S和G2/M期,抑制細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17的蛋白分泌和mRNA表達。2.STA體外抑制CD4+T細胞的活化和增殖:STA能顯著抑制Con A誘導增殖的T細胞中的CD3+ CD4+T細胞的比例,但對CD3+ CD8+ T細胞的比例沒有明顯的抑制作用;能明顯抑制Con A誘導的CD4+T細胞增殖;抑制表面分子CD25和CD69的表達;抑制細胞因子IL-2和IFN-γ的蛋白分泌和mRNA表達。3.STA抑制T細胞活化的機制:糖皮質激素受體拮抗劑RU486不能阻斷或減弱STA的作用。STA并不會擴大sub-G1凋亡峰,也不影響抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的mRNA表達。STA抑制轉錄因子AP1、NFKB及NFAT和DNA的結合能力,抑制NFAT的去磷酸化以及IkB-α和p38的磷酸化。STA對Zap70的磷酸化沒有明顯的影響,對PMA/lonomycin或PMA/抗CD28誘導的T細胞活化和增殖均具有顯著的抑制作用。STA通過5個氫鍵結合于PKCθ的ATP口袋域,STA能抑制PKCθ的活性,抑制CD4+T細胞內的PKCθ磷酸化水平。STA對Con A誘導的T細胞活化和增殖作用不能被PMA逆轉。STA能調節(jié)18條信號通路中Wnt、Hedgehog、Jak-Stat等10條通路相關基因的mRNA表達。4.STA緩解Con A誘導的小鼠爆發(fā)性肝炎和CD4+T細胞在小鼠肝組織內活化聚集:STA能明顯恢復Con A引起的體重降低、緩解血清ALT和AST水平上升和肝組織病變,明顯抑制血清中TNF-α和IL-1β的含量。另外,STA能抑制肝組織中CD4+CD69+T細胞的數(shù)量,抑制細胞因子IFN-γ和IL-17的產生。5.STA和CsA協(xié)同抑制T細胞免疫應答:低濃度的STA和CsA單獨使用或聯(lián)合使用均不會對正常脾細胞產生細胞毒性。單獨使用低濃度的STA或CsA不能抑制Con A引起的T細胞增殖,IL-2產生和CD25表達,但STA和CsA聯(lián)合使用后均具有顯著抑制作用。同樣地,非治療劑量的STA和CsA聯(lián)合口服給藥后能明顯抑制DNFB誘導的小鼠耳腫脹,減少小鼠耳廓表皮增生和浮腫,以及炎癥細胞的浸潤。STA能抑制CYP3A4的活性。結論1.STA體外能抑制T細胞的激活和增殖,且對CD4+T細胞亞型的抑制作用比CD8+T細胞敏感。2.STA可通過阻止細胞進入分裂周期抑制T細胞的增殖,但不會促進激活誘導的T細胞凋亡。3.區(qū)別于傳統(tǒng)甾體類抗炎藥物,STA與GR無競爭性結合,不依賴于GR起免疫抑制作用。4.區(qū)別于鈣調蛋白酶抑制劑(calcineurininhibitors,CNls),STA抑制T細胞激活不是通過TCR近端信號和Ca2+信號。5.PKCθ極可能是STA作用的分子靶點。STA可通過氫鍵結合的方式連接于PKCθ的ATP 口袋域,從而抑制PKCθ的磷酸化和活性,進而抑制PKCθ下游NFAT、NFκB和MAPK信號級聯(lián)傳遞,最終抑制T細胞的活化。6.STA抑制T細胞活化和增殖還可能與其調控多重信號通路的傳導有關。7.腹腔注射或口服給予STA在體內對T細胞介導的免疫性疾病模型均顯示較好的治療作用。STA通過抑制CD4+T細胞活化和在肝臟聚集,從而緩解Con A誘導的爆發(fā)性肝炎。8.STA與CsA可通過互補的分子機制,或可能提高CsA的體內生物利用度,在體內外發(fā)揮協(xié)同作用。以上結果為STA作為用于治療T細胞介導的炎癥和自身免疫性疾病的免疫抑制先導化合物的研究奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：2341321