【摘要】：CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在維持機(jī)體免疫平衡中起著重要作用,而Foxp3在Treg的表達(dá)水平與Treg的功能直接相關(guān)�；A(chǔ)與臨床的多項(xiàng)研究已證實(shí)Tregs能夠治療多種疾病,包括自身免疫性糖尿病,實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎等。目前,如何培養(yǎng)穩(wěn)定,有效的Tregs功能是其研究的熱點(diǎn)。有研究小組發(fā)現(xiàn)Tregs在炎癥環(huán)境下不穩(wěn)定,容易失去Foxp3表達(dá),同時(shí)失去Foxp3的前Tregs表達(dá)大量的IL-17,從而加重疾病反應(yīng)。因此,本課題旨在分析和探究能夠獲得穩(wěn)定Tregs的最佳方案。并檢測與Tregs穩(wěn)定性關(guān)系重大的相關(guān)標(biāo)志物及其相關(guān)的信號(hào)通路。本課題的成功對(duì)Tregs I臨床治療具有一定的普遍意義并為移植術(shù)后免疫耐受的誘導(dǎo)提供新的思路。總課題分為下面三個(gè)部分：第一部分TGF-β誘導(dǎo)的CD4+Foxp3+iTregs在急性移植物抗宿主病中的作用和機(jī)制研究。研究背景：誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(induced regulatory T cells, iTregs)被認(rèn)為可以用來治療自身免疫性疾病。然而最新研究發(fā)現(xiàn)其在急性移植物抗宿主病模型中療效不明顯,其原因在于iTregs功能不穩(wěn)定,在體內(nèi)容易轉(zhuǎn)化為其他細(xì)胞,從而失去免疫抑制功能。本文旨在探討iTregs在急性移植物抗宿主病中功能及穩(wěn)定性的影響。研究目的：我們通過研究iTregs在急性移植物抗宿主病模型中的作用,鑒別不同iTregs培養(yǎng)方案對(duì)其細(xì)胞功能的影響。方法：我們運(yùn)用TGF-β, IL-2誘導(dǎo)iTregs治療兩種不同的小鼠急性移植物抗宿主病模型。在一些實(shí)驗(yàn)中CFSE標(biāo)記的Tregs被注入小鼠體內(nèi)來監(jiān)測Tregs體內(nèi)的穩(wěn)定性。抗CD25抗體被用來拮抗Tregs,觀測拮抗Tregs后,移植物抗宿主病模型的生存率。最后,我們還監(jiān)測了不同方案的iTregs的體外與體內(nèi)穩(wěn)定性和功能。結(jié)果：iTregs具有較強(qiáng)的保護(hù)急性移植物抗宿主病的功能,這種保護(hù)作用是通過iTregs抑制供者CD4細(xì)胞,CD8細(xì)胞的擴(kuò)增以及供者CD8細(xì)胞的殺傷作用,保護(hù)受者B細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們觀測到iTregs能夠保持穩(wěn)定并持續(xù)發(fā)揮功能,最后我們的研究還發(fā)現(xiàn)anti-CD3/CD28磁珠誘導(dǎo)的iTregs比anti-CD3包板誘導(dǎo)的iTregs具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)論：只有運(yùn)用正確的誘導(dǎo)擴(kuò)增方案,才能夠培養(yǎng)出狀態(tài)穩(wěn)定,具有強(qiáng)大抑制功能的iTreg s,從而保護(hù)急性移植物抗宿主病。第二部分全反式維甲酸對(duì)肝臟移植術(shù)后患者iTreg s的作用研究研究目的：我們通過全反式維甲酸作用肝臟移植術(shù)后患者iTregs,分析全反式維甲酸對(duì)iTregs功能的影響。方法：我們運(yùn)用TGF-β, IL-2與全反式維甲酸從肝臟移植術(shù)后患者提取的幼稚T細(xì)胞中的誘導(dǎo)iTregs,檢測Foxp3表達(dá),體外擴(kuò)增功能。通過CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞與iTregs共培養(yǎng),觀察全反式維甲酸作用的iTregs的體外抑制功能。同時(shí),建立小鼠異種移植物抗宿主病模型,并由尾靜脈回輸iTregs觀察iTregs對(duì)異種移植物抗宿主病的保護(hù)作用以及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果與結(jié)論：全反式維甲酸能夠增強(qiáng)患者iTregsFoxp3的表達(dá)以及擴(kuò)增倍數(shù),同時(shí)提高iTregs的體內(nèi)與體外功能。本研究為iTregs在臨床治療的實(shí)際問題提供了新的解決方案。第三部分人CD39hi nTreg亞群的穩(wěn)定性和功能研究及其相關(guān)機(jī)制分析研究背景：自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural regulatory T cells, nTregs)被認(rèn)為可以用來治療自身免疫性疾病。然而研究表明其在炎癥環(huán)境下易轉(zhuǎn)化為Th1, Th17細(xì)胞,從而失去免疫抑制功能,CD39是與Tregs功能相關(guān)的表面標(biāo)志,可能與Tregs的穩(wěn)定性有關(guān)。研究目的：我們通過研究CD39hi nTregs與CD39low nTregs在炎癥環(huán)境下的表型和穩(wěn)定性差異,為臨床運(yùn)用具有功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：分選出人CD4+CD25hrightnTreg并在體外培養(yǎng)擴(kuò)增7天,流式分選出CD39hi nTreg和CD39low nTreg加入IL-1β或者IL-6繼續(xù)培養(yǎng)1至3天,將獲得的nTregs進(jìn)行體內(nèi)外抑制功能檢測,利用免疫印跡法檢測STAT1, p-STAT1, STAT3, p-STAT3的表達(dá)水平,并分析Foxp3啟動(dòng)子區(qū)域的變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用不同類型nTregs回輸異種移植物抗宿主疾病。結(jié)果：CD39hi nTregs比CD39low nTregs具有更加強(qiáng)大的免疫抑制功能,在體外實(shí)驗(yàn)中,CD39hi nTregs能夠保持Foxp3表達(dá),具有較強(qiáng)的抑制T細(xì)胞擴(kuò)增的能力；而CD39low nTregs快速丟失Foxp3表達(dá),并轉(zhuǎn)化為Th1, Th17細(xì)胞。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,CD39hi nTregs能夠保護(hù)異種移植物抗宿主病的體重變化,提高生存率。最后,IL-2能夠顯著提高CD39low nTregs的體內(nèi)功能和穩(wěn)定性,這種作用與STAT1, STAT3磷酸化和DNA甲基化水平有關(guān)。結(jié)論：nTregs的穩(wěn)定性與CD39表達(dá)有關(guān),Tregs體外擴(kuò)增后分選CD39hinTregs能夠提高細(xì)胞功能和穩(wěn)定性。
[Abstract]:CD4 + CD25 + Foxp3 + regulatory T cells play an important role in maintaining immune balance of body, while Foxp3 is directly related to the function of Treg. A number of studies based on clinical and clinical studies have demonstrated that Tregs can treat multiple diseases, including autoimmune diabetes, experimental arthritis, and so on. At present, how to cultivate stable and effective Treggs function is the hot spot of its research. A study team found that Tregs was unstable in inflammatory conditions, easily lost Foxp3 expression, while losing Foxp3 's preTregs to express a significant amount of IL-17, thus worsening the disease response. Therefore, the purpose of this study is to analyze and explore the best solution that can obtain stable Treggs. and to detect relevant markers that are significant in relation to the stability of the Tregs and their associated signal paths. The successful treatment of Treggs I has a certain general significance and provides a new idea for the induction of immune tolerance after transplantation. The total subjects were divided into three parts: the role and mechanism of CD4 + Foxp3 + iTregs induced by the first part of retinoic acid in acute graft versus host disease. Background: Inducible regulatory T cells (iTregs) are believed to be useful in the treatment of autoimmune diseases. However, the latest study found that it was not effective in the acute graft-versus-host disease model because the iTregs function was unstable and easily converted into other cells in vivo, thus losing the immunosuppressive function. The purpose of this paper is to investigate the effect of iTregs on the function and stability of acute graft versus host disease. Objective: To investigate the effect of iTregs on cell function in acute graft versus host disease model. Methods: We used IL-2 and IL-2 to induce iTregs to treat two different models of acute graft versus host disease in mice. In some experiments, the CFSE-labeled Tregs were injected into mice to monitor the stability of the Treggs body. Anti-CD25 antibody was used to antagonize Treggs and observe the survival rate of graft versus host disease model following Treggs observation. Finally, we also monitored the in vitro and in vivo stability and function of iTregs of different protocols. Results: iTregs has a strong function of protecting against host disease of acute graft. This protective effect is achieved by inhibiting the proliferation of CD4 cells, CD8 cells and the killing effect of donor CD8 cells through iTregs. In vivo experiments, we observed that iTregs can maintain stability and continue to function. Finally, our study also found that the iTregs induced by anti-CD3/ CD28 beads had a stronger immune modulatory function than the anti-CD3 envelope-induced iTregs. Conclusion: Only the correct induction amplification protocol can be used to develop the iTreg s with stable state and strong inhibitory function, thus protecting the acute graft anti-host disease. Objective: To study the effect of all-trans retinoic acid on iTreg s function in patients with liver transplantation, and to analyze the effect of all-trans retinoic acid on iTregs function. Methods: We detected the expression of Foxp3 in naive T cells extracted from patients with liver transplantation by means of anti-retinoic acid, IL-2 and all-trans retinoic acid, and detected the function of Foxp3 expression and in vitro amplification. In vitro inhibition of trans-retinoic acid on iTregs was observed by co-culture of CFSE-labeled T-cells with iTregs. At the same time, the anti-host disease model of mouse xenografts was established, and the protective effect of iTregs on the host disease of xenografts and the expression of relevant cytokines were observed from the tail vein. RESULTS & CONCLUSION: All trans retinoic acid can enhance the expression of iTregsFoxp3 and the amplification factor of iTregsFoxp3, and improve the in vivo and in vitro function of iTregs. This study provides a new solution for the practical treatment of iTregs. The stability and functional studies of CD39hi nTreg subpopulations of the third part and their related mechanisms are discussed in this paper. The natural regulatory T cells (nTregs) are considered to be useful in the treatment of autoimmune diseases. However, the study shows that it is easily transformed into Th1 and Th17 cells in an inflammatory environment, thus losing the immunosuppressive function, and CD39 is a surface marker related to the Tregs function, possibly related to the stability of Treggs. Objective: We study the phenotype and stability of CD39hi nTregs and CD39low nTregs in inflammatory environment, and provide experimental basis for clinical use of regulatory T cells with function to induce immune tolerance. Methods: Human CD4 + CD25hrightnTreg was selected and cultured in vitro for 7 days. CD39hi nTreg and CD39low nTreg were selected to add IL-1 MBP or IL-6 for 1 to 3 days, and the obtained nTgs were detected in vivo. The expression levels of STAT1, p-STAT1, STAT3, p-STAT3 were detected by Western blot. and the change of Foxp3 promoter region was analyzed. In vivo experiments were performed using different types of nTregs back-to-lose xenografts against host diseases. Results: CD39hi nTregs has a stronger immunosuppressive function than CD39low nTregs. In vitro experiments, CD39hi nTregs can maintain Foxp3 expression, has stronger ability to inhibit T cell amplification, and CD39low nTregs rapidly lost Foxp3 expression and transformed into Th1 and Th17 cells. In vivo experiments, CD39hi nTregs can protect the body weight of xenografts against host disease and improve survival. Finally, IL-2 can significantly improve the in vivo function and stability of CD39low nTregs, which is related to STAT1, STAT3 phosphorylation and DNA methylation level. Conclusion: The stability of nTregs is related to the expression of CD39, and the sorting of CD39hinTreggs after Treggs in vitro can improve cell function and stability.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.4

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本文編號(hào)：2302535