【摘要】：免疫的調(diào)控對(duì)于宿主的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,簡(jiǎn)稱Treg cell)主要參與外周免疫耐受并負(fù)向調(diào)控免疫反應(yīng)以防止過(guò)度免疫反應(yīng)及自身免疫等對(duì)宿主本身造成的損害。西咪替丁(Cimetidine,簡(jiǎn)稱CIM)是一種組胺的H2受體拮抗劑,最初發(fā)現(xiàn)能夠降低胃酸分泌以及消化道潰瘍,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)西咪替丁對(duì)于免疫反應(yīng)也有著多種調(diào)控效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室已有的研究發(fā)現(xiàn),CIM可作為疫苗佐劑對(duì)適應(yīng)性免疫反應(yīng)起到促進(jìn)作用,進(jìn)而增強(qiáng)疫苗的免疫效果,進(jìn)一步結(jié)果顯示其對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能可能有抑制作用。然而,CIM的這種調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)理并不十分清楚。本研究第一部分針對(duì)CIM在體外如何在分子水平上對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究；而第二部分是研究CIM在體內(nèi)先天性免疫系統(tǒng)中對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。第一部分體外研究：用CIM體外刺激人的CD4+CD25+hTreg細(xì)胞和JurkatT細(xì)胞,并采用蛋白免疫印跡技術(shù)分析了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)鍵功能轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)和穩(wěn)定性的變化,證明其影響主要是發(fā)生在蛋白質(zhì)穩(wěn)定水平。進(jìn)一步通過(guò)沉默E3泛素化連接酶Stub1,分析了CIM對(duì)Stubl活化的影響。結(jié)果顯示,CIM能夠激活Stubl并引起Foxp3的泛素化降解,從而證明CIM影響Foxp3的功能主要是通過(guò)降解Foxp3的蛋白質(zhì)活性而達(dá)到的。上游PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路是CIM作用的主要通路,利用抑制劑LY294002封閉PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路證明,CIM對(duì)Foxp3的降解是依賴于PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路激活。由此表明,CIM可通過(guò)激活PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路而促進(jìn)E3泛素化連接酶Stubl所介導(dǎo)的Foxp3降解,從而降低了Treg細(xì)胞的免疫抑制功能,一定程度上可促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。第二部分體內(nèi)研究：炎癥性腸炎(inflammatory bowel disease,簡(jiǎn)稱IBD)是一類由腸道微生物致病菌以及炎癥反應(yīng)共同作用所引起的腸道疾病,其發(fā)病原因復(fù)雜、易反復(fù),長(zhǎng)期患病易轉(zhuǎn)化為結(jié)腸直腸癌。已有研究表明,CIM對(duì)胃潰瘍及消化道潰瘍有治療作用,能夠通過(guò)降低先天性免疫反應(yīng)中一些炎癥因子的產(chǎn)生。本研究在使用TNBS誘導(dǎo)潰瘍型炎癥性腸道炎的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),注射一次CIM能夠有效地減輕小鼠患IBD的病癥,進(jìn)而保護(hù)小鼠免于IBD所致的死亡。免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在潰瘍性IBD模型初期的炎癥反應(yīng)中,巨噬細(xì)胞起著重要的作用,其浸潤(rùn)的數(shù)量以及表達(dá)的TNF-α等相關(guān)炎癥分子,能夠被CIM有效的抑制。進(jìn)一步采用小鼠原代骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDM)的試驗(yàn)證明,CIM能夠顯著降低由LPS激活的BMDM中相關(guān)炎癥因子TNF-a, IL-6, IL-1β等的轉(zhuǎn)錄,并降低TNF-α的水平。蛋白免疫印跡分析結(jié)果表明,CIM能夠通過(guò)抑制受到刺激信號(hào)激活的NF-κB通路,進(jìn)而抑制相關(guān)炎癥因子基因的表達(dá)。經(jīng)細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移試驗(yàn)和熒光定量PCR分析,表明CIM可能對(duì)于巨噬細(xì)胞向炎癥部位的遷移有著一定的抑制作用。綜上我們的研究結(jié)果表明,CIM可降低適應(yīng)性免疫反應(yīng)中Treg細(xì)胞的免疫抑制功能；在潰瘍性炎癥反應(yīng)中,CIM在先天性免疫反應(yīng)初期可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活而降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá),從而保護(hù)小鼠免于因過(guò)激的炎癥反應(yīng)而直接導(dǎo)致的死亡。
[Abstract]:The regulation of immunity is critical to the immune response of the host. Regulatory T cell, called Treg cell, is mainly involved in peripheral immune tolerance and negative regulation of immune response to prevent over-immune response and autoimmune damage to the host itself. Cimetidine (CIM) is a histamine H2 receptor antagonist, initially found to be able to reduce gastric acid secretion and digestive tract infection. In recent years, it has been found that there are a variety of regulatory effects on the immune response. It has been found in this laboratory that CIM can promote the adaptive immune response as a vaccine adjuvant, thus enhancing the immune effect of the vaccine, and further shows that it may have an inhibitory effect on the regulatory T cell function. However, the molecular mechanism of this regulation of CIM is not very clear. In the first part of this study, the effects of CIM on regulatory T cells in vitro were studied, and the second part was to investigate the effects of CIM on inflammatory response in vitro. In vitro, the expression and stability of the transcription factor Foxp3 of CD4 + CD25 + hTreg cells and Jurkat T cells stimulated by CIM in vitro were studied. The effect of CIM on Stubl activation was further analyzed by silencing E3 ubiquitin ligase Stub1. The results show that CIM can activate Stubl and induce ubiquitination degradation of Foxp3, thus demonstrating that the function of CIM on Foxp3 is mainly achieved by degrading the protein activity of Foxp3. The upstream PI3K-Akt-mTOR signaling pathway is the main pathway for CIM, and the degradation of the CIM to Foxp3 is dependent on the activation of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway by using the inhibitor LY294002 to close the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Thus, CIM can promote the degradation of Foxp3 mediated by E3 ubiquitin ligase Stubl by activating the T-Akt-mTOR signaling pathway, thus reducing the immunosuppressive function of Treg cells, which can promote adaptive immune response to a certain extent. In the second part, inflammatory bowel disease (IBD) is a kind of intestinal disease caused by intestinal microorganism pathogenic bacteria and inflammatory response. The cause of the disease is complicated, it is easy to repeat, and the long-term illness is easy to be converted into colorectal cancer. It has been shown that CIM has therapeutic effect on the digestive tract and digestive tract, and can reduce the generation of some inflammatory factors in the innate immune response. In the process of using TNBS to induce inflammatory bowel inflammation, it was found that the injection of CIM could effectively reduce the symptoms of IBD in mice and protect the mice from the death caused by IBD. The results of immunohistochemistry show that macrophages play an important role in inflammatory response in the early stage of IBD model, the number of infiltration and the expression of TNF-CoV and other relevant inflammatory molecules can be effectively inhibited by CIM. Further use of mouse primary bone marrow-derived macrophages (BMDM) demonstrated that CIM significantly reduced the transcription of TNF-a, IL-6, IL-1, etc. associated with LPS-activated BMDM, and reduced TNF-alpha levels. The results of Western blot analysis showed that CIM could inhibit the expression of the related inflammatory factor gene by inhibiting the NF-Sepharose B pathway stimulated by the stimulation signal. Through cell adoptive transfer assay and fluorescence quantitative PCR analysis, it is shown that CIM may have a certain inhibitory effect on the migration of macrophages to inflammatory sites. The results of our study indicate that CIM can reduce the immunosuppressive function of Treg cells in adaptive immune response; in inflammatory response, CIM can reduce the expression of relevant inflammatory factors by inhibiting the activation of NF-Sepharose B signaling pathway at the beginning of the innate immune response. thereby protecting the mice from death caused by excessive inflammatory reactions.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2302021