【摘要】：識別病原微生物是激活天然免疫反應(yīng)的第一步,該過程是通過一系列模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)來識別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns, MAMPs)來實現(xiàn)的。例如,在大多數(shù)細胞中,RIG-I樣受體(retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors, RLRs)識別病毒感染產(chǎn)生的雙鏈RNA (dsRNA)或者單鏈RNA (ssRNA);在一些免疫細胞中,Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)識別經(jīng)過內(nèi)吞作用進入內(nèi)體的病毒dsRNA和ssRNA。模式識別受體一旦激活后,會激起下游的信號級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致Ⅰ型干擾素和促炎癥因子的大量產(chǎn)生。干擾素調(diào)控因子3 (interferon-regulatory factor 3, IRF3)作為IFN-β誘導(dǎo)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在天然免疫反應(yīng)過程中起著不可或缺的作用。細胞識別病原體后,IRF3會在幾個磷酸化接受體簇上磷酸化,繼而發(fā)生構(gòu)象變化,進行同源二聚化、入核并結(jié)合到目的基因的啟動子序列干擾素刺激反應(yīng)原件(interferon-stimulated response elments, ISRE)上。IRF3在IFN-β誘導(dǎo)通路中必不可少的角色決定了它必須被精細的調(diào)控,從而使宿主對病毒感染做出準確適應(yīng)的免疫反應(yīng)。IRF3上游的激酶TBK1和IKKε早已被報道,但是負責IRF3去磷酸化過程的磷酸酶仍然未知。腫瘤抑制因子PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是突變率最高的幾個抑癌因子之一。PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶活性來拮抗PI3K-Akt信號通路,從而控制一系列細胞生理過程,在腫瘤抑制過程中起著核心的作用。盡管PTEN的腫瘤抑制功能研究得非常透徹,但關(guān)于PTEN在抗病毒免疫方面的功能還未見報道。本研究中,我們報道PTEN在抗病毒天然免疫中的新功能,我們發(fā)現(xiàn)PTEN能夠促進病毒誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的表達,從而在抗病毒天然免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn),PTEN在Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)通路中的作用依賴于其磷酸酶活性,但不依賴于PI3K-Akt通路。IRF3是I型干擾素誘導(dǎo)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,而PTEN通過促進IRF3的入核轉(zhuǎn)運從而促進病毒誘導(dǎo)的I型干擾素的表達。使用多種病毒以及核酸類似物誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的實驗證明,PTEN 參與了所有IRF3介導(dǎo)的干擾素反應(yīng)。進一步研究表明,IRF3除已知的磷酸化激活位點之外,還存在磷酸化失活位點,本研究鑒定出三個磷酸化負調(diào)控位點,包括Ser82、Ser97和Ser339,其中Ser97位點的磷酸化導(dǎo)致IRF3不能入核,而PTEN則通過其磷酸酶活性對Ser97磷酸化位點行使去磷酸化功能,從而促進IRF3入核,激活I(lǐng)型干擾素的表達。病毒感染實驗表明,PTEN缺失的各類細胞(包括腫瘤細胞)抗病毒干擾素反應(yīng)顯著降低,進而病毒復(fù)制效率上升,宿主細胞凋亡增加。本研究建立了PTEN條件性敲除小鼠實驗體系,相對于野生型小鼠,PTEN條件缺失型小鼠干擾素反應(yīng)明顯降低,對水泡性口炎病毒(VSV)高度易感,因此在小鼠模型中證實了上述發(fā)現(xiàn)的生理功能�？傊�,我們的研究發(fā)現(xiàn)PTEN除抗腫瘤功能之外,還在抗病毒天然免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用；揭示了IRF3磷酸化負調(diào)控的新機制和PTEN磷酸酶對IRF3負調(diào)控位點的去磷酸化功能。這些工作表明了PTEN和IRF3在腫瘤抑制和抗病毒天然免疫之間的交互作用,也部分解釋了為什么腫瘤細胞一般對病毒感染更加敏感,因此該研究為研發(fā)新的抗病毒策略提供了新知識,對于篩選與應(yīng)用溶瘤病毒治療PTEN缺失型癌癥具有重要的臨床意義。
[Abstract]:Identifying pathogenic microorganisms is the first step in activating a natural immune response, which is achieved by identifying the pathogen-related molecular patterns (MAMPs) through a series of pattern recognition receptors (PRRs). For example, in most cells, RIG-I-like receptors (RIG-I)-like rectins, RLRs) recognize double-stranded RNA (dsRNA) or single-stranded RNA (ssRNA) generated by viral infections; in some immune cells, Toll-like receptors (TLRs) identify viral RNA and ssRNA that have been internalized into the endosomes. Once activated, the pattern recognition receptors cause downstream signal cascade reactions leading to a large number of type I interferon and pro-inflammatory factors. interferon regulatory factor 3 (iRF3) plays an indispensable role in the process of innate immune response. After cell recognition of a pathogen, IRF3 is phosphorylated on several phosphorylated receptor clusters, followed by conformational changes, homodimerizing, nucleus-entering, and binding to the promoter sequence interferon-stimulated response (IRE) of the target gene. The essential role of IR3 in the IFN-induced pathway determines that it must be finely regulated so as to allow the host to respond accurately to viral infections. The kinases TBK1 and IKK upstream of IRF3 have long been reported, but phosphatases responsible for the IRF3 dephosphorylation process are still unknown. Tumor suppressor gene PTEN is one of several tumor suppressor factors with the highest mutation rate. PTEN antagonizes the T-Akt signaling pathway through its lipid phosphatase activity, thereby controlling a series of cellular physiological processes, which play a central role in tumor suppression. Although the tumor suppressor function of PTEN is very thorough, the function of PTEN in anti-viral immunity has not been reported. In this study, we report the new function of PTEN in innate anti-virus innate immunity, and we have found that PTEN can promote the expression of viral-induced type I interferon and play a key role in anti-viral innate immune response. Our findings suggest that the role of PTEN in the type I interferon inducible pathway depends on its phosphatase activity, but does not depend on the p38-Akt pathway. IRF3 is a key transcription factor for the I-type interferon inducible pathway, while PTEN promotes the expression of viral-induced I-type interferon by promoting the migration of IRF3 into the nucleus. Experiments using a variety of viruses and nucleic acid analogs to induce interferon production demonstrate that PTEN is involved in all IRF3-mediated interferon reactions. Further studies have shown that, in addition to the known phosphorylation activation sites, IRF3 also has phosphorylation sites, which identify three phosphorylated negative regulatory sites, including Ser82, Ser97 and Ser339, where phosphorylation of Ser97 sites results in IRRF3 not entering the nucleus, PTEN confirmed the phosphorylation of Ser97 phosphorylation site by its phosphatase activity, thus promoting the expression of IRF3 in nuclear and I-type interferon. The virus infection experiment shows that the anti-virus interferon response of all kinds of cells (including tumor cells) deleted by PTEN is remarkably reduced, and the replication efficiency of the virus is increased, and the apoptosis of the host cell is increased. In this study, PTEN conditioned knock-out mouse experimental system was established. Compared with wild-type mice, there was a significant decrease in interferon response in PTEN-deficient mice, and it was highly susceptible to blister-inflammatory virus (VSV). Therefore, the physiological function of PTEN was confirmed in mouse model. In conclusion, we have found that PTEN plays a key role in anti-virus innate immunity in addition to anti-tumor function, and reveals the new mechanism of phosphorylation negative regulation of IRF3 and the dephosphorylation function of PTEN phosphatase to the negative regulatory site of IR3. These work demonstrate the interaction between PTEN and IRF3 between tumor suppression and anti-viral innate immunity, and partly explain why tumor cells are generally more sensitive to viral infections, thus providing new knowledge for the development of new antiviral strategies, It has important clinical significance for screening and applying soluble tumor virus in the treatment of PTEN-deficient cancer.
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：2290117