【摘要】：由于遺傳或者是獲得性的原因,在基因正常終止密碼子的上游產(chǎn)生了一個(gè)終止密碼子,稱(chēng)為早發(fā)性無(wú)義突變(PTC)。大約有三分之一的人類(lèi)疾病是由于早發(fā)性無(wú)義突變引發(fā)的,其中主要包括遺傳性疾病和癌癥類(lèi)疾病,本文主要針對(duì)的兩種疾�。貉巡是一種X染色體連鎖的隱性遺傳性疾病,是由編碼凝血因子Ⅸ基因(F9)突變導(dǎo)致的先天性凝血機(jī)制障礙疾病,根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì),早發(fā)性無(wú)義突變占F9基因突變中的11.1%；多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤�、裥�(MEN1)是一種常染色體顯性遺傳癌癥類(lèi)疾病,作為抑癌基因的MEN1,其上80%的突變是無(wú)義突變或是移碼突變,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。早發(fā)性無(wú)義突變引發(fā)的疾病在傳統(tǒng)的治療上以替代療法、手術(shù)、放療和化療為主,翻譯通讀治療(TBT)在近年來(lái)逐步成為治療早發(fā)性無(wú)義突變疾病的主要策略之一,翻譯通讀治療以促通讀藥物作用于早發(fā)性無(wú)義突變位點(diǎn),使帶有PTC的基因發(fā)生通讀效應(yīng),表達(dá)出全長(zhǎng)的具有功能的蛋白。氨基糖苷類(lèi)藥物(G418等)和非氨基糖苷類(lèi)藥物(PTC124等),作為促通讀藥物,在PTC引發(fā)疾病的治療中具有一定的療效,但是不同患者的療效差異很大,影響通讀效率的因素有很多：促通讀藥物的選擇、PTC所在基因位置的上下文結(jié)構(gòu)以及無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解途徑(NMD),這些影響因素的檢測(cè)和考量是個(gè)體化治療的前提和基礎(chǔ)。另外,大量促通讀候選藥物亦需要高通量的篩選體系來(lái)完成篩選過(guò)程。首先,本研究針對(duì)促通讀藥物的研究需求,利用綠色熒光蛋白(EGFP)基因和紅色熒光蛋白(DsRed)基因構(gòu)建早發(fā)性無(wú)義突變雙熒光篩選體系,該體系包括雙熒光哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pDsRed-EGFPmtag-及其早發(fā)性無(wú)義突變體pDsRed-EGFPmtag-Y445X,該體系轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS7后,載體能夠進(jìn)行正確的表達(dá),并且能被流式細(xì)胞儀檢出。轉(zhuǎn)染早發(fā)性無(wú)義突變體pDsRed-EGFP mtag-Y445X的細(xì)胞經(jīng)促通讀藥物PTC124處理,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光蛋白的平均熒光強(qiáng)度,可以精確得出促通讀藥物的通讀效率,而且發(fā)現(xiàn)PTC124的促通讀效果與作用濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,隨后實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)目標(biāo)基因EGFP的mRNA的定量檢測(cè),同樣證實(shí)了PTC124具有劑量依賴(lài)性的促通讀活性。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),說(shuō)明該篩選體系克服了現(xiàn)行熒光素酶表達(dá)體系熒光素底物假陽(yáng)性的缺點(diǎn),能夠快速準(zhǔn)確的反映藥物促通讀活性。該載體采用雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng),以DsRed紅色熒光作為內(nèi)標(biāo),排除了共轉(zhuǎn)染等操作步驟帶來(lái)的系統(tǒng)誤差,可以精確計(jì)算PTC的通讀效率；該載體預(yù)留的多克隆位點(diǎn),可以插入帶有PTC及其上下文結(jié)構(gòu)的基因片段,最大程度的模仿促通讀藥物作用的細(xì)胞環(huán)境,對(duì)通讀藥物的效果做出精確的測(cè)量。其次,本研究以遺傳性疾病血友病B的F9基因?yàn)檠芯繉?duì)象,將F9基因的編碼序列導(dǎo)入雙熒光哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pDsRed-EGFPmtag-,構(gòu)建了表達(dá)載體pDsRed-F9-EGFPmtag-,并根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的點(diǎn)突變構(gòu)建了該載體的3個(gè)無(wú)義突變體Y22X、E258X和E296X。突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞COS7后,氨基糖苷類(lèi)藥物G418和非氨基糖苷類(lèi)藥物PTC124分別處理細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PTC1 24的促通讀效果要優(yōu)于G418,利用凝血因子Ⅸ促凝活性檢測(cè)試劑盒測(cè)試部分支持上述結(jié)果。再次,本研究以癌癥類(lèi)疾病多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤�、裥偷腗EN1基因?yàn)檠芯繉?duì)象,在本小組的研究中發(fā)現(xiàn),通過(guò)構(gòu)建MEN1基因的小基因,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,促通讀藥物作用后,MENI基因由于其上的PTC而受到NMD途徑調(diào)控,促通讀藥物PTC124能提高menin全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)量,但是得到的nenin全長(zhǎng)蛋白功能恢復(fù)情況得不到確切的反映。本研究以干擾質(zhì)粒pSIR-MEN1-10轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,干擾MEN1表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MEN1的效應(yīng)基因Caspase 8伴隨MEN1的敲減而下調(diào),流式細(xì)胞儀檢測(cè)減緩了細(xì)胞的凋亡,為PTC124的促通讀效果給出了功能水平上的直接證據(jù)。最后,本研究擴(kuò)展了無(wú)義突變促通讀藥物雙熒光篩選體系的應(yīng)用范圍：構(gòu)建了帶有雙標(biāo)簽(HA tag和c-Myc tag)的凝血因子Ⅸ小基因Ⅱ(Mini-hF9-Ⅱgene),該小基因由三部分組成：外顯子1-7+內(nèi)含子7+外顯子8。構(gòu)建了含有Mini-hF9-Ⅱ基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-3B-Mini-hF9-Ⅱ,并將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,通過(guò)RT-PCR及Western Blot分析發(fā)現(xiàn),小基因可以正確剪切、拼接和表達(dá)全長(zhǎng)蛋白。導(dǎo)入篩選體系后,將能從EJC模型的角度考查NMD途徑對(duì)促通讀藥物的影響；本文分離并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表面抗原以及多向分化能力等方法鑒定了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),并且將雙熒光篩選體系初步轉(zhuǎn)染了間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛,易于分離培養(yǎng),并且具有較強(qiáng)的分化潛能,外源基因易于植入間充質(zhì)干細(xì)胞,并且植入的基因易于在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的表達(dá)而不影響其特性,對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞而言,植入外源基因引發(fā)的損傷小,反應(yīng)弱,將此雙熒光篩選體系和間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合起來(lái),為構(gòu)建促通讀藥物篩選的間充質(zhì)干細(xì)胞模型,更為下一步促通讀藥物篩選的動(dòng)物模型體內(nèi)示蹤,以及接近觀(guān)察藥物篩選體系對(duì)抗腫瘤藥物的作用效果奠定了基礎(chǔ)。利用此無(wú)義突變促通讀藥物雙熒光篩選體系,在體外表達(dá)可以高通量檢測(cè)不同環(huán)境,不同條件下的藥物作用效果,為闡明細(xì)胞中無(wú)義突變的翻譯調(diào)控機(jī)制,豐富PTC引發(fā)的疾病病因?qū)W知識(shí)提供了基礎(chǔ)；有助于判斷遺傳疾病以及腫瘤的分型和預(yù)后,并為進(jìn)一步分子靶向治療提供分子依據(jù)；對(duì)候選藥物的高通量篩選,為實(shí)施個(gè)性化治療提供幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R3416

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本文編號(hào)：2263395