發(fā)布時間：2018-10-11 07:42

【摘要】：由于遺傳或者是獲得性的原因,在基因正常終止密碼子的上游產生了一個終止密碼子,稱為早發(fā)性無義突變(PTC)。大約有三分之一的人類疾病是由于早發(fā)性無義突變引發(fā)的,其中主要包括遺傳性疾病和癌癥類疾病,本文主要針對的兩種疾病：血友病B是一種X染色體連鎖的隱性遺傳性疾病,是由編碼凝血因子Ⅸ基因(F9)突變導致的先天性凝血機制障礙疾病,根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計,早發(fā)性無義突變占F9基因突變中的11.1%；多發(fā)性內分泌腺瘤病Ⅰ型(MEN1)是一種常染色體顯性遺傳癌癥類疾病,作為抑癌基因的MEN1,其上80%的突變是無義突變或是移碼突變,導致腫瘤的發(fā)生。早發(fā)性無義突變引發(fā)的疾病在傳統(tǒng)的治療上以替代療法、手術、放療和化療為主,翻譯通讀治療(TBT)在近年來逐步成為治療早發(fā)性無義突變疾病的主要策略之一,翻譯通讀治療以促通讀藥物作用于早發(fā)性無義突變位點,使帶有PTC的基因發(fā)生通讀效應,表達出全長的具有功能的蛋白。氨基糖苷類藥物(G418等)和非氨基糖苷類藥物(PTC124等),作為促通讀藥物,在PTC引發(fā)疾病的治療中具有一定的療效,但是不同患者的療效差異很大,影響通讀效率的因素有很多：促通讀藥物的選擇、PTC所在基因位置的上下文結構以及無義突變介導的mRNA降解途徑(NMD),這些影響因素的檢測和考量是個體化治療的前提和基礎。另外,大量促通讀候選藥物亦需要高通量的篩選體系來完成篩選過程。首先,本研究針對促通讀藥物的研究需求,利用綠色熒光蛋白(EGFP)基因和紅色熒光蛋白(DsRed)基因構建早發(fā)性無義突變雙熒光篩選體系,該體系包括雙熒光哺乳動物表達載體pDsRed-EGFPmtag-及其早發(fā)性無義突變體pDsRed-EGFPmtag-Y445X,該體系轉染哺乳動物細胞COS7后,載體能夠進行正確的表達,并且能被流式細胞儀檢出。轉染早發(fā)性無義突變體pDsRed-EGFP mtag-Y445X的細胞經促通讀藥物PTC124處理,通過流式細胞儀測定熒光蛋白的平均熒光強度,可以精確得出促通讀藥物的通讀效率,而且發(fā)現(xiàn)PTC124的促通讀效果與作用濃度呈現(xiàn)一定的量效關系,隨后實時熒光定量PCR反應對目標基因EGFP的mRNA的定量檢測,同樣證實了PTC124具有劑量依賴性的促通讀活性。通過以上實驗,說明該篩選體系克服了現(xiàn)行熒光素酶表達體系熒光素底物假陽性的缺點,能夠快速準確的反映藥物促通讀活性。該載體采用雙熒光報告基因系統(tǒng),以DsRed紅色熒光作為內標,排除了共轉染等操作步驟帶來的系統(tǒng)誤差,可以精確計算PTC的通讀效率；該載體預留的多克隆位點,可以插入帶有PTC及其上下文結構的基因片段,最大程度的模仿促通讀藥物作用的細胞環(huán)境,對通讀藥物的效果做出精確的測量。其次,本研究以遺傳性疾病血友病B的F9基因為研究對象,將F9基因的編碼序列導入雙熒光哺乳動物表達載體pDsRed-EGFPmtag-,構建了表達載體pDsRed-F9-EGFPmtag-,并根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫中登記的點突變構建了該載體的3個無義突變體Y22X、E258X和E296X。突變體轉染細胞COS7后,氨基糖苷類藥物G418和非氨基糖苷類藥物PTC124分別處理細胞,流式細胞儀檢測和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PTC1 24的促通讀效果要優(yōu)于G418,利用凝血因子Ⅸ促凝活性檢測試劑盒測試部分支持上述結果。再次,本研究以癌癥類疾病多發(fā)性內分泌腺瘤病Ⅰ型的MEN1基因為研究對象,在本小組的研究中發(fā)現(xiàn),通過構建MEN1基因的小基因,轉染HeLa細胞,促通讀藥物作用后,MENI基因由于其上的PTC而受到NMD途徑調控,促通讀藥物PTC124能提高menin全長蛋白的表達量,但是得到的nenin全長蛋白功能恢復情況得不到確切的反映。本研究以干擾質粒pSIR-MEN1-10轉染Hela細胞,干擾MEN1表達,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MEN1的效應基因Caspase 8伴隨MEN1的敲減而下調,流式細胞儀檢測減緩了細胞的凋亡,為PTC124的促通讀效果給出了功能水平上的直接證據(jù)。最后,本研究擴展了無義突變促通讀藥物雙熒光篩選體系的應用范圍：構建了帶有雙標簽(HA tag和c-Myc tag)的凝血因子Ⅸ小基因Ⅱ(Mini-hF9-Ⅱgene),該小基因由三部分組成：外顯子1-7+內含子7+外顯子8。構建了含有Mini-hF9-Ⅱ基因的重組表達質粒pCMV-3B-Mini-hF9-Ⅱ,并將其轉染到細胞中,通過RT-PCR及Western Blot分析發(fā)現(xiàn),小基因可以正確剪切、拼接和表達全長蛋白。導入篩選體系后,將能從EJC模型的角度考查NMD途徑對促通讀藥物的影響；本文分離并通過細胞形態(tài)學、表面抗原以及多向分化能力等方法鑒定了間充質干細胞(MSCs),并且將雙熒光篩選體系初步轉染了間充質干細胞。間充質干細胞來源廣泛,易于分離培養(yǎng),并且具有較強的分化潛能,外源基因易于植入間充質干細胞,并且植入的基因易于在間充質干細胞內穩(wěn)定的表達而不影響其特性,對于間充質干細胞而言,植入外源基因引發(fā)的損傷小,反應弱,將此雙熒光篩選體系和間充質干細胞結合起來,為構建促通讀藥物篩選的間充質干細胞模型,更為下一步促通讀藥物篩選的動物模型體內示蹤,以及接近觀察藥物篩選體系對抗腫瘤藥物的作用效果奠定了基礎。利用此無義突變促通讀藥物雙熒光篩選體系,在體外表達可以高通量檢測不同環(huán)境,不同條件下的藥物作用效果,為闡明細胞中無義突變的翻譯調控機制,豐富PTC引發(fā)的疾病病因學知識提供了基礎；有助于判斷遺傳疾病以及腫瘤的分型和預后,并為進一步分子靶向治療提供分子依據(jù)；對候選藥物的高通量篩選,為實施個性化治療提供幫助。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R3416

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本文編號：2263395