【摘要】：糖尿病是由多種病因引起的以血糖紊亂為主要特征及多種并發(fā)癥為主要損害的代謝紊亂性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為,胰臟是血糖調(diào)節(jié)的唯一中心。最新的研究結(jié)果表明,體內(nèi)血糖水平主要是受腦部神經(jīng)系統(tǒng)和胰島共同調(diào)節(jié)的。在本研究中我們嘗試用遺傳學(xué)手段,通過特異性β細(xì)胞和腦細(xì)胞殺除來直接研究胰島β細(xì)胞和腦細(xì)胞在糖尿病中的調(diào)控機(jī)制。首先,本研究制備了β細(xì)胞特異性表達(dá)CreERT2的小鼠(Ins1CreERT2),與Cre/loxP條件性表達(dá)白喉毒素的Rosa26DTA176小鼠進(jìn)行雜交,獲得Ins1CreERT2;Rosa26DTA176小鼠。之后,我們通過他莫昔芬誘導(dǎo)白喉毒素表達(dá),實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異性的胰島β細(xì)胞殺除。組織學(xué)鑒定結(jié)果顯示,經(jīng)過他莫昔芬誘導(dǎo)2周后,該小鼠模型的胰島β細(xì)胞出現(xiàn)大面積的死亡現(xiàn)象,接近80%,成功實(shí)現(xiàn)了胰島β細(xì)胞特異性殺除。然而,值得關(guān)注的是,血糖濃度測(cè)定和血糖耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示,本模型中并未觀察到血糖升高及血糖耐受等糖尿病表型。通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在這些β細(xì)胞殺除小鼠的胰島結(jié)構(gòu)之外存在一些能夠分泌胰島素的Ngn3陽性細(xì)胞。然而,不同于傳統(tǒng)的小鼠糖尿病模型,β細(xì)胞特異性殺除之后,我們的小鼠模型并沒有檢測(cè)到相應(yīng)的腦部損傷。以上結(jié)果證實(shí),利用β細(xì)胞特異性啟動(dòng)子Ins1結(jié)合Cre/loxP白喉毒素自殺系統(tǒng),我們成功獲得了小鼠胰島β細(xì)胞特異性殺除模型,本模型表現(xiàn)出β細(xì)胞殺除與糖尿病表型不對(duì)應(yīng)的特點(diǎn),為研究非胰島區(qū)域,特別是腦部神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)體內(nèi)血糖水平的調(diào)控打下了良好的基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步探索腦部神經(jīng)系統(tǒng)與胰島素分泌之間的關(guān)系,本研究構(gòu)建了腦靶向性穿膜肽RVG介導(dǎo)的RVG-Cre重組酶遞送系統(tǒng)。本研究首先在分子、細(xì)胞等不同水平對(duì)RVG-Cre重組酶遞送系統(tǒng)的定點(diǎn)重組酶的活性進(jìn)行了驗(yàn)證。之后我們利用mTmG和Rosa26lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)RVG-Cre重組酶遞送系統(tǒng)的酶活性及腦組織特異性進(jìn)行了進(jìn)一步地驗(yàn)證。結(jié)果表明,RVG-Cre重組酶遞送系統(tǒng)可以高效率地穿過血腦屏障進(jìn)入小鼠腦部細(xì)胞,并且能夠在活體水平對(duì)腦部組織進(jìn)行高效率、高特異性的基因編緝工作。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,用RVG-Cre重組酶遞送系統(tǒng)注射Rosa26DTA176小鼠,可以在活體水平誘導(dǎo)其腦部特異性損傷;HE染色顯示腦部與血糖調(diào)節(jié)相關(guān)的A5區(qū)域受到了損傷,甚至形成了腦組織壞死空洞。以上結(jié)果證實(shí),RVG-Cre重組酶遞送系統(tǒng)的建立,能夠?qū)崿F(xiàn)腦部精確的定位以及基因編輯能力,并特異性的在白喉毒素Rosaa26DTA176小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)小鼠腦部精確殺傷。綜上所述,本研究成功獲得了胰島β細(xì)胞特異性殺傷的Ins1CreERT2;Rosa26DTA176小鼠模型。同時(shí),我們獲得了能夠?qū)е翿osa26DTA176小鼠腦部細(xì)胞特異性殺傷的RVG-Cre重組酶遞送系統(tǒng)。該小鼠模型和遞送系統(tǒng)的建立,為研究腦部神經(jīng)系統(tǒng)和體內(nèi)血糖代謝之間的調(diào)控關(guān)系奠定了理論和實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Diabetes mellitus is a metabolic disorder disease caused by many kinds of etiology, whose main characteristics are blood sugar disorder and many complications. The pathogenesis of diabetes mellitus has not been fully elucidated. Traditionally, the pancreas is the only center of blood glucose regulation. The latest findings suggest that blood sugar levels are mainly regulated by the brain's nervous system and islets. In this study, we tried to study directly the regulation mechanism of islet 尾 cells and brain cells in diabetes mellitus by means of genetics and specific 尾 cell and brain cell killing. Firstly, the 尾 -cell-specific CreERT2 expressing mice (Ins1CreERT2) were prepared and hybridized with Cre/loxP conditioned diphtheria toxin Rosa26DTA176 mice to obtain Ins1CreERT2;Rosa26DTA176 mice. After that, diphtheria toxin expression was induced by tamoxifen to achieve space-time specific islet 尾 cell killing. The histological results showed that after 2 weeks of tamoxifen induction, the islet 尾 cells of the mouse model had a large area of death, which was close to 80%, and the specific killing of islet 尾 cells was achieved successfully. However, the results of blood glucose concentration determination and glucose tolerance test showed that no diabetes phenotypes such as hyperglycemia and glucose tolerance were observed in this model. By immunofluorescence staining, it was found that there were some Ngn3 positive cells which could secrete insulin besides the islet structure of mice killed by these 尾 cells. However, unlike the traditional mice model of diabetes mellitus, after the specific killing of 尾 cells, our mouse model did not detect the corresponding brain damage. The above results confirmed that the murine islet 尾 -cell specific killing model was successfully obtained by using 尾 -cell-specific promoter Ins1 and Cre/loxP diphtheria toxin suicide system. The model showed that 尾 -cell killing did not correspond to the phenotype of diabetes mellitus. It lays a good foundation for the study of the regulation of blood glucose levels in the non-islet area, especially in the nervous system of the brain. In order to further explore the relationship between the brain nervous system and insulin secretion, a brain targeted transmembrane peptide (RVG) mediated RVG-Cre recombinant enzyme delivery system was constructed. In this study, the activity of site-directed recombinant enzyme of RVG-Cre recombined enzyme delivery system was verified at different molecular and cellular levels. Then we used mTmG and Rosa26lacZ transgenic mice to further verify the enzyme activity and brain tissue specificity of RVG-Cre recombinant enzyme delivery system. The results showed that the RVG-Cre recombinant enzyme delivery system could efficiently penetrate the blood-brain barrier into the brain cells of mice and perform efficient and highly specific gene coding on the brain tissue at the in vivo level. Further experiments showed that injection of Rosa26DTA176 mice with RVG-Cre recombinant enzyme delivery system could induce specific brain injury in vivo. He staining showed that the A5 region related to blood glucose regulation was damaged, and even formed a necrotic cavity in brain tissue. The above results confirm that the RVG-Cre recombination enzyme delivery system can realize the precise localization and gene editing of the brain and the specific killing of mouse brain in diphtheria toxin Rosaa26DTA176 mice. In conclusion, the Ins1CreERT2;Rosa26DTA176 mouse model of islet 尾-cell specific killing was successfully obtained. At the same time, we have obtained the RVG-Cre recombinant enzyme delivery system which can induce specific killing of brain cells in Rosa26DTA176 mice. The establishment of the mouse model and delivery system provides a theoretical and experimental basis for the study of the regulation of blood glucose metabolism in the brain nervous system and in vivo.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.1;R-332

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本文編號(hào)：2233607