【摘要】：目的篩選獲得日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)核糖體蛋白(SjRibosomal_L18a)編碼基因,預(yù)測其B細(xì)胞表位。克隆、表達(dá)重組蛋白SjRibosomal_L18a,并比較分析其與合成的B細(xì)胞表位的潛在診斷價值。方法利用B細(xì)胞表位預(yù)測軟件篩選日本血吸蟲蛋白質(zhì)序列,獲取函數(shù)打分值較高且抗原表位片段多的免疫原性蛋白,合成B細(xì)胞表位片段。生物信息學(xué)方法分析免疫原性蛋白基因及其編碼蛋白的相對分子質(zhì)量(M r)、等電點(diǎn)、親水性、信號肽、跨膜區(qū)和功能結(jié)構(gòu)域等理化性質(zhì)。制備日本血吸蟲各蟲期階段總RNA,逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增目的基因,分析各蟲期轉(zhuǎn)錄本豐度。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)菌株,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),組氨酸標(biāo)記親和層析法純化重組蛋白。ELISA法比較分析重組蛋白和合成的B細(xì)胞表位的潛在診斷價值。結(jié)果預(yù)測軟件篩選出免疫原性核糖體蛋白SjRibosomal_L18a以及2個B細(xì)胞表位(P1和P2)。SjRibosomal_L18a基因開放閱讀框(ORF)由531個堿基組成,編碼176個氨基酸,不含跨膜區(qū)和信號肽,為M r20 741,等電點(diǎn)為11.12。RT-PCR結(jié)果顯示,各蟲期均檢測到SjRibosomal_L18a的轉(zhuǎn)錄本,且轉(zhuǎn)錄水平均較高。成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒SjRibosomal_L18a/pET-28a,誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體形式的重組蛋白,約為M r26 069。ELISA檢測結(jié)果顯示,重組蛋白、P1和P2檢測15份慢性血吸蟲病患者血清和15份健康人血清的敏感性和特異性分別為53.3%(8/15)和100%(15/15)、60%(9/15)和100%(15/15)、73.3%(11/15)和100%(15/15)。結(jié)論獲得重組蛋白SjRibosomal_L18a及其免疫原性較高的表位片段P1、P2,P1和P2用于血清診斷的敏感性均高于重組蛋白。
[Abstract]:Objective to obtain (Schistosoma japonicum) ribosomal protein (SjRibosomal_L18a) encoding gene from Schistosoma japonicum and predict its B cell epitope. Clone and express recombinant protein SjRibosomal_L18a, and compare its potential diagnostic value with synthetic B cell epitopes. Methods the B cell epitope prediction software was used to screen the protein sequence of Schistosoma japonicum. The immunogenicity proteins with high function score and many antigenic epitope fragments were obtained and the B cell epitope fragments were synthesized. The relative molecular weight (M r), isoelectric point, hydrophilicity, signal peptide, transmembrane region and functional domain of the immunogenicity protein gene and its encoded protein were analyzed by bioinformatics. Total RNA, reverse transcriptional PCR (RT-PCR) amplification of Schistosoma japonicum at different stages was prepared and the abundance of transcripts was analyzed. The amplified product was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a and transformed into Escherichia coli (E.coli) BL21 (DE3) strain. Isopropyl- 尾 -Dthiogalactoside (IPTG) was induced expression. The potential diagnostic value of recombinant protein and synthesized B cell epitopes was compared and analyzed by histidine labeling affinity chromatography and Elisa. Results the immunogenicity ribosomal protein SjRibosomal_L18a and two B cell epitopes (P1 and P2) were screened by software. The open reading frame (ORF) of Sj RibosomalL18a gene was composed of 531 bases, encoding 176 amino acids, without transmembrane region and signal peptide. The results of isoelectric point (11.12.RT-PCR) showed that the transcripts of SjRibosomal_L18a were detected in all stages, and the transcription level was higher. The recombinant expression plasmid SjRibosomal_L18a/pET-28a, was successfully constructed to induce the expression of the recombinant protein in the form of inclusion body. The result of 069.ELISA detection showed that the recombinant protein was expressed in the form of inclusion body. The sensitivity and specificity of recombinant protein P1 and P2 were 53.3% (8 / 15) and 100% (15 / 15) 60% (9 / 15) and 100% (15 / 15) in 15 sera of patients with chronic schistosomiasis and 15 cases of healthy persons, respectively, and the sensitivity and specificity were 73.3% (1115 / 15) and 100% (15 / 15), respectively. Conclusion the sensitivity of obtaining recombinant protein SjRibosomal_L18a and its epitope fragments P1, P2, P1 and P2 for serum diagnosis is higher than that of recombinant protein.
【作者單位】： 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心;
【基金】：國家傳染病科技重大專項(xiàng)(No.2009ZX1004-302) 國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(No.2007AA02Z153)~~
【分類號】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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5 王瑋;基于生物信息學(xué)的日本血吸蟲糖代謝研究[D];華中師范大學(xué);2007年

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7 徐叢榮;日本血吸蟲組織蛋白酶B基因的克隆、表達(dá)及初步鑒定[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

8 張純;日本血吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白的基因克隆、表達(dá)及相關(guān)免疫生物學(xué)特性的研究[D];江蘇省血吸蟲病防治研究所;2010年

9 鄧世敏;日本血吸蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件的篩選和抗原含量動態(tài)變化的研究[D];武漢大學(xué);2005年

10 王衍海;日本血吸蟲雌性特異基因及排泄—分泌抗原的篩選[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

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本文編號：2229695