【摘要】：Stra8基因是一個(gè)生殖腺特異性表達(dá)基因,其表達(dá)受到視黃酸(Retinoic acid,RA)的調(diào)控。Stra8基因敲除后雄性小鼠失去生育能力,精子發(fā)生阻滯在減數(shù)分裂階段,此過程中Stra8的作用機(jī)制尚未闡明。為了進(jìn)一步探究Stra8在精子發(fā)生中的分子機(jī)制,本論文從以下三個(gè)部分展開了實(shí)驗(yàn)研究。第一部分:精子發(fā)生中Stra8下游作用基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步研究目的:探索Stra8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制,找尋其可能的下游作用基因,研究其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。方法:將Stra8.KO雜合型(Stra8+/-)小鼠合籠,收集子代純合型(Stra8-/-)和野生型(Stra8+/+)小鼠。取出生后5天～12天小鼠,制不同日齡睪丸組織切片,HE染色,觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)。用生精細(xì)胞標(biāo)志物Ddx4對(duì)不同日齡小鼠睪丸組織行免疫組織化學(xué)熒光染色,并對(duì)陽性生精細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。選取出生后11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組織進(jìn)行RNA-Sequnce,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)RNA-Sequnce中表達(dá)有差異的基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:出生后不同日齡小鼠,5～11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)相似,單個(gè)生精小管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第12天時(shí),Stra8+/+小鼠生精小管管腔內(nèi)初級(jí)精母細(xì)胞與Stra8-/-小鼠相比明顯增多,且單個(gè)生精小管內(nèi)生精細(xì)胞數(shù)量有顯著性差異。RNA-Sequnce分析發(fā)現(xiàn)了 96個(gè)RNA在Stra8敲除后表達(dá)量有顯著性差異,其中40個(gè)RNA表達(dá)下調(diào),56個(gè)RNA表達(dá)上調(diào)。對(duì)其中21個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些RNA的表達(dá)水平與RNA-Sequnce結(jié)果相一致。結(jié)論:應(yīng)用RNA-Sequnce等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)了 96個(gè)Stra8基因敲除后差異表達(dá)的RNA,其中21個(gè)基因可能參與精母細(xì)胞減數(shù)分裂、精原細(xì)胞自我更新及精原細(xì)胞分化等過程的調(diào)控。Stra8可能通過調(diào)控上述差異表達(dá)基因,調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程。第二部分:兔抗小鼠Setd8多克隆抗體的制備目的:獲得小鼠Setd8原核蛋白,制備兔抗小鼠Setd8多克隆抗體。方法:將pGADT7-Setd8質(zhì)粒和pET-30a載體分別雙限制性內(nèi)切酶酶切后連接、轉(zhuǎn)化和鑒定,構(gòu)建pET-30a-Setd8原核表達(dá)質(zhì)粒。將pET-30a-Setd8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),通過鎳親和層析柱蛋白純化。用純化的Setd8蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得Setd8多克隆抗體。應(yīng)用ELISA、Western blot及免疫組織化學(xué)法對(duì)Setd8多克隆抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定及特異性鑒定。結(jié)果:限制性內(nèi)切酶雙酶切法及序列測(cè)定法表明:pET-30a-Setd8重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。IPTG誘導(dǎo)后,大腸桿菌可高效表達(dá)Setd8原核蛋白。獲得的Setd8多克隆抗體經(jīng)ELISA檢測(cè),效價(jià)為1:1 000 000。Western blot結(jié)果顯示:Setd8多克隆抗體能特異性識(shí)別細(xì)胞中的Setd8蛋白。免疫組織化學(xué)法顯示:Setd8主要表達(dá)在成年小鼠睪丸組織中的精原細(xì)胞。結(jié)論:成功獲得較高純度Setd8蛋白,制備的Setd8多克隆抗體具有較高反應(yīng)性和特異性。第三部分:成年小鼠睪丸內(nèi)精原細(xì)胞及精母細(xì)胞的純化目的:建立一個(gè)簡(jiǎn)便、高效的成年小鼠睪丸精原細(xì)胞、精母細(xì)胞純化方法。方法:運(yùn)用酶消化法將成年小鼠睪丸制備成單細(xì)胞懸液,經(jīng)9層非連續(xù)Percoll密度梯度(17%、22%、25%、28%、31%、34%、37%、40%和90%)離心法分離,通過組織學(xué)染色和計(jì)數(shù)法確定精原細(xì)胞及精母細(xì)胞的純度。結(jié)果:酶消化后所得睪丸單細(xì)胞懸液經(jīng)Percoll密度梯度離心,共形成9條細(xì)胞帶,其中22%密度梯度中主要為精子細(xì)胞;而31%、34%及37%密度梯度中主要為精原細(xì)胞及精母細(xì)胞,且純度較高,達(dá)71.50%。結(jié)論:聯(lián)合運(yùn)用酶消化法和非連續(xù)Percoll密度梯度離心法,可從成年小鼠睪丸中分離出較高純度的精原細(xì)胞及精母細(xì)胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R321.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭佳倩;牛長敏;馬海濤;馬仕昆;鄭英;;小鼠Setd8截短片段真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J];解剖學(xué)研究;2015年05期

2 Yang WANG;Zhidong XU;Jian-Hua MAO;David.HSIEH;Alfred AU;David M. JABLONS;Hui LI;Liang YOU;;PR-Set7 is Degraded in a Conditional Cul4A Transgenic Mouse Model of Lung Cancer[J];中國肺癌雜志;2015年06期

3 趙偉;徐清問;楊穎;童晶晶;張君;李燕;邵壯;李魯;;腫瘤相關(guān)抗原胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白3多克隆抗體的制備和鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年04期

4 王冰冰;涂建欣;呂艷;侯柏龍;劉巧瓊;林曉云;陳韶;薛向陽;朱珊麗;張麗芳;;HPV16型E7重組蛋白的表達(dá)及其多克隆抗體的制備[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2014年02期

5 李冬梅;秦曉東;;精原干細(xì)胞自我更新與分化的調(diào)控[J];中華男科學(xué)雜志;2013年11期

6 高永甫;楊思強(qiáng);劉丹;余樹民;;哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞自我更新調(diào)控的研究進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2012年07期

7 鄭英;盛樹東;孫紅亞;梁虹;王建軍;;人NYD-SP28基因原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年06期

8 鄭鵬生;曹浩哲;;Oct4基因的研究進(jìn)展[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年05期

9 袁勁濤;周源;韓曉冬;;大鼠精原細(xì)胞的分離純化及鑒定[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2010年06期

10 朱培元,黃宇烽,徐建平;小鼠睪丸精子細(xì)胞的分離與鑒定[J];中華男科學(xué);2002年01期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 沈金兒;抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測(cè)體系的建立[D];浙江大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：2225314