【摘要】：Stra8基因是一個生殖腺特異性表達基因,其表達受到視黃酸(Retinoic acid,RA)的調(diào)控。Stra8基因敲除后雄性小鼠失去生育能力,精子發(fā)生阻滯在減數(shù)分裂階段,此過程中Stra8的作用機制尚未闡明。為了進一步探究Stra8在精子發(fā)生中的分子機制,本論文從以下三個部分展開了實驗研究。第一部分:精子發(fā)生中Stra8下游作用基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步研究目的:探索Stra8在精子發(fā)生中的作用機制,找尋其可能的下游作用基因,研究其下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。方法:將Stra8.KO雜合型(Stra8+/-)小鼠合籠,收集子代純合型(Stra8-/-)和野生型(Stra8+/+)小鼠。取出生后5天～12天小鼠,制不同日齡睪丸組織切片,HE染色,觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)。用生精細胞標志物Ddx4對不同日齡小鼠睪丸組織行免疫組織化學(xué)熒光染色,并對陽性生精細胞進行計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析。選取出生后11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組織進行RNA-Sequnce,應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對RNA-Sequnce中表達有差異的基因進行驗證。結(jié)果:出生后不同日齡小鼠,5～11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)相似,單個生精小管內(nèi)生精細胞數(shù)量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。第12天時,Stra8+/+小鼠生精小管管腔內(nèi)初級精母細胞與Stra8-/-小鼠相比明顯增多,且單個生精小管內(nèi)生精細胞數(shù)量有顯著性差異。RNA-Sequnce分析發(fā)現(xiàn)了 96個RNA在Stra8敲除后表達量有顯著性差異,其中40個RNA表達下調(diào),56個RNA表達上調(diào)。對其中21個基因進行qRT-PCR驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些RNA的表達水平與RNA-Sequnce結(jié)果相一致。結(jié)論:應(yīng)用RNA-Sequnce等實驗,發(fā)現(xiàn)了 96個Stra8基因敲除后差異表達的RNA,其中21個基因可能參與精母細胞減數(shù)分裂、精原細胞自我更新及精原細胞分化等過程的調(diào)控。Stra8可能通過調(diào)控上述差異表達基因,調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程。第二部分:兔抗小鼠Setd8多克隆抗體的制備目的:獲得小鼠Setd8原核蛋白,制備兔抗小鼠Setd8多克隆抗體。方法:將pGADT7-Setd8質(zhì)粒和pET-30a載體分別雙限制性內(nèi)切酶酶切后連接、轉(zhuǎn)化和鑒定,構(gòu)建pET-30a-Setd8原核表達質(zhì)粒。將pET-30a-Setd8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達,通過鎳親和層析柱蛋白純化。用純化的Setd8蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得Setd8多克隆抗體。應(yīng)用ELISA、Western blot及免疫組織化學(xué)法對Setd8多克隆抗體進行效價測定及特異性鑒定。結(jié)果:限制性內(nèi)切酶雙酶切法及序列測定法表明:pET-30a-Setd8重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。IPTG誘導(dǎo)后,大腸桿菌可高效表達Setd8原核蛋白。獲得的Setd8多克隆抗體經(jīng)ELISA檢測,效價為1:1 000 000。Western blot結(jié)果顯示:Setd8多克隆抗體能特異性識別細胞中的Setd8蛋白。免疫組織化學(xué)法顯示:Setd8主要表達在成年小鼠睪丸組織中的精原細胞。結(jié)論:成功獲得較高純度Setd8蛋白,制備的Setd8多克隆抗體具有較高反應(yīng)性和特異性。第三部分:成年小鼠睪丸內(nèi)精原細胞及精母細胞的純化目的:建立一個簡便、高效的成年小鼠睪丸精原細胞、精母細胞純化方法。方法:運用酶消化法將成年小鼠睪丸制備成單細胞懸液,經(jīng)9層非連續(xù)Percoll密度梯度(17%、22%、25%、28%、31%、34%、37%、40%和90%)離心法分離,通過組織學(xué)染色和計數(shù)法確定精原細胞及精母細胞的純度。結(jié)果:酶消化后所得睪丸單細胞懸液經(jīng)Percoll密度梯度離心,共形成9條細胞帶,其中22%密度梯度中主要為精子細胞;而31%、34%及37%密度梯度中主要為精原細胞及精母細胞,且純度較高,達71.50%。結(jié)論:聯(lián)合運用酶消化法和非連續(xù)Percoll密度梯度離心法,可從成年小鼠睪丸中分離出較高純度的精原細胞及精母細胞。
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【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R321.1

【參考文獻】

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本文編號：2225314