【摘要】：第一部分輕型鏈球菌對(duì)銅綠假單胞菌BF致病性的影響目的:機(jī)械通氣廣泛應(yīng)用及生物膜(BF)在氣管導(dǎo)管(ETT)的形成,新生兒呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(VAP)仍然是臨床上的棘手問(wèn)題。我們前期發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)和輕型鏈球菌(S.mitis),一種口咽部正常細(xì)菌,在新生兒ETT表面最常見(jiàn);且S.mitis檢出率在VAP組患兒中較高。鑒于BF內(nèi)的不同種細(xì)菌可能促進(jìn)或抑制對(duì)方,本研究目的在于探討S.mitis能否影響P.aeruginosa的致病性。方法:將BF培養(yǎng)分為PAO1組、S.mitis組和PAO1+S.mitis組,并收集生物膜培養(yǎng)液(BCM)。結(jié)晶紫、平板計(jì)數(shù)以及光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌粘附能力。結(jié)晶紫、平板計(jì)數(shù)、CCK-8及激光共聚焦(CLSM)觀察BF形成。BCM刺激人氣道上皮細(xì)胞(BEAS-2B)后,檢測(cè)細(xì)胞活性、IL-8表達(dá)以及TLR2、4的表達(dá)。結(jié)果:結(jié)果顯示S.mitis幾乎不能粘附于非生物介質(zhì)表面,且不能形成BF,但它增強(qiáng)了PAO1的粘附能力和BF形成(P0.05)�；旌螧F內(nèi)總活菌數(shù)和活P.aeruginosa數(shù)明顯高于PAO1單獨(dú)組(P0.05)。然而,與PAO1單獨(dú)組BCM相比較,混合BCM的細(xì)胞毒性及其誘導(dǎo)的IL-8,TLR2、4表達(dá)明顯降低(P0.05)。結(jié)論:S.mitis作為傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為的口咽部正常細(xì)菌,一方面它能增強(qiáng)PAO1粘附力及BF形成,從而逃避宿主免疫及抗生素殺傷;另一方面S.mitis減輕了PAO1誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)�？赡苁切律鶹AP患兒ETT BF表面S.mitis檢出率高的原因。研究結(jié)果提示我們不能忽視傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為的非致病菌在BF中的作用。對(duì)于新生兒VAP ETT表面BF致病機(jī)制提供了新的思路,該觀點(diǎn)亦可能為其他BF相關(guān)感染提供新研究方向。第二部分輕型鏈球菌對(duì)浮游銅綠假單胞菌致病性的影響目的:第一部分已證實(shí)S.mitis能增強(qiáng)PAO1粘附力、BF形成能力,并減輕PAO1 BCM誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)。BF成熟后亦可釋放浮游細(xì)菌,對(duì)宿主產(chǎn)生影響。且研究表明某些口腔常駐菌群(如牙卟啉單胞菌、放線菌等)能促進(jìn)某些呼吸道病原體對(duì)于宿主細(xì)胞及組織的粘附等,從而影響其致病性。那么S.mitis對(duì)于浮游狀態(tài)的P.aeruginosa有無(wú)作用呢?這是本部分實(shí)驗(yàn)擬闡明的問(wèn)題。方法:將浮游菌分組為PAO1組、S.mitis組和PAO1+S.mitis組。將細(xì)菌(MOI=100)加入人呼吸道上皮細(xì)胞(BEAS-2B)。侵襲實(shí)驗(yàn)和粘附實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)菌對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的侵襲和粘附力。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞IL-8表達(dá)。結(jié)果:與PAO1單獨(dú)組相比較,S.mitis可促進(jìn)PAO1對(duì)BEAS-2B的侵襲能力(P0.05),而對(duì)PAO1粘附BEAS-2B的能力無(wú)明顯影響(P0.05)。PAO1+S.mitis組與PAO1單獨(dú)組在細(xì)胞存活率及IL-8水平無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論:S.mitis能增強(qiáng)PAO1對(duì)BEAS-2B細(xì)胞侵襲性,但對(duì)PAO1粘附BEAS-2B細(xì)胞無(wú)影響,提示兩者機(jī)制不同。雖然在S.mitis存在下,浮游PAO1侵襲性增強(qiáng),但細(xì)胞存活率及炎癥無(wú)顯著影響,這可能利于PAO1在宿主細(xì)胞內(nèi)形成BF,逃逸宿主免疫。S.mitis對(duì)PAO1致病性的影響可能主要在其BF狀態(tài)產(chǎn)生。第三部分輕型鏈球菌通過(guò)增強(qiáng)銅綠假單胞菌生物膜QS系統(tǒng)促進(jìn)其生物膜形成目的:多菌種BF內(nèi)部菌群間交流調(diào)控機(jī)制是BF形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其中密度感應(yīng)(Quorum sensing,QS)系統(tǒng)是研究多菌種BF調(diào)控的關(guān)鍵。第一部分已證實(shí)S.mitis能增強(qiáng)PAO1粘附力、BF形成能力,但具體機(jī)制不明;而P.aeruginosa的QS系統(tǒng)與其粘附力、BF形成能力密切相關(guān)。那么,S.mitis對(duì)P.aeruginosa上述能力的促進(jìn)作用是否與其作用于P.aeruginosa的QS系統(tǒng)相關(guān)呢?方法:BF分為PAO1組、P.aΔlas R組、P.aΔLas RΔrhl R組、S.mitis組、PAO1+S.mitis組、P.aΔlas R+S.mitis組、P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis組。結(jié)晶紫、平板計(jì)數(shù)法以及光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌粘附能力。結(jié)晶紫、平板計(jì)數(shù)及激光共聚焦(CLSM)觀察BF形成。q PCR法檢測(cè)各組BF的QS基因表達(dá)(包括las I、las R、rhl I、rhl R)。結(jié)果:PAO1+S.mitis、P.aΔlas R+S.mitis、P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis三個(gè)組的粘附力均分別明顯強(qiáng)于單獨(dú)PAO1、P.aΔlas R和P.aΔLas RΔrhl R組(P0.05);且平板計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示PAO1+S.mitis、P.aΔlas R+S.mitis、P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis混合組中粘附的P.aeruginosa菌分別較單獨(dú)PAO1、P.aΔlas R、P.aΔlas RΔrhl R組多(P0.05)。PAO1+S.mitis混合組的BF生物量明顯多于PAO1單獨(dú)組(P0.05);然而,P.aΔlas R+S.mitis組和P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis組BF生物量與P.aΔlas R組、P.aΔLas RΔrhl R組BF生物量無(wú)明顯差異(P0.05)。S.mitis能上調(diào)PAO1菌株的QS基因表達(dá)(包括las I、las R、rhl I、rhl R),明顯高于單獨(dú)PAO1組的表達(dá)(P0.05);然而P.aΔlas R+S.mitis組和P.aΔLas RΔrhl R+S.mitis組的QS基因表達(dá)(包括las I、las R、rhl I、rhl R)并無(wú)上調(diào),與單獨(dú)P.aΔlas R和P.aΔlas RΔrhl R組無(wú)差異(P0.05)。結(jié)論:S.mitis對(duì)于P.aeruginosa粘附力的促進(jìn)不依賴于QS系統(tǒng),有其他機(jī)制參與。S.mitis通過(guò)上調(diào)P.aeruginosa QS基因促進(jìn)其BF形成。這種促進(jìn)機(jī)制是通過(guò)S.mitis直接作用還是其分泌某些物質(zhì)(如AI-2)對(duì)P.aeruginosa BF形成起作用待未來(lái)實(shí)驗(yàn)論證。
[Abstract]:Part I Effect of Streptococcus militaris on pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa BF Objective: Mechanical ventilation is widely used and biofilm (BF) is formed in tracheal tube (ETT). Ventilator associated pneumonia (VAP) in newborns is still a difficult clinical problem. Normal bacteria in oropharynx were the most common on the surface of ETT in neonates, and the detection rate of S. mitis was higher in VAP group. Cell viability, IL-8 expression and TLR2,4 expression were detected after BCM stimulation of human airway epithelial cells (BEAS-2B). The total viable bacteria and P. aeruginosa in mixed BF were significantly higher than those in PAO1 alone (P 0.05). However, compared with BCM in PAO1 alone, the cytotoxicity of mixed BCM and the expression of IL-8, TLR2, 4 induced by mixed BCM were significantly lower (P 0.05). It is believed that normal oropharyngeal bacteria, on the one hand, can enhance the adhesion of PAO1 and BF formation, thereby escaping the host immunity and antibiotic killing; on the other hand, S. mitis reduces the host immune response induced by PAO1. This may be the reason for the high detection rate of S. mitis on the surface of ETT BF in neonatal VAP children. The role of non-pathogenic bacteria in BF is generally believed to provide new insights into the pathogenesis of BF on the surface of neonatal VAP ETT. This view may also provide new research directions for other BF-related infections. BF also releases planktonic bacteria after maturation and affects the host. Studies have shown that some oral colonies (such as Porphyromonas dentatus, actinomycetes, etc.) can promote the adhesion of certain respiratory pathogens to host cells and tissues, thereby affecting them. Pathogenicity. So does S. mitis have any effect on planktonic P. aeruginosa? This part of the experiment is to clarify the question. Methods: Planktonic bacteria were divided into PAO1 group, S. mitis group and PAO1 + S. mitis group. Bacteria (MOI = 100) were added to human respiratory epithelial cells (BEAS-2B). Invasion and adhesion experiments were used to observe the invasion of bacteria on BEAS-2B cells. Results: Compared with PAO1 alone group, S. mitis could promote the invasion ability of PAO1 to BEAS-2B (P 0.05), but had no significant effect on the adhesion ability of PAO1 to BEAS-2B (P 0.05). There was no significant difference in cell survival rate and IL-8 level between PAO1 + S. mitis group and PAO1 alone group (P 0.05). Conclusion: S. mitis can enhance the invasiveness of PAO1 on BEAS-2B cells, but has no effect on PAO1 adhesion to BEAS-2B cells, suggesting that the mechanisms are different. The effect of sex may be mainly produced in the BF state. Part 3 Streptococcus minimus promotes the formation of biofilm by enhancing the QS system of Pseudomonas aeruginosa biofilm. The mechanism of intercommunion regulation in multispecies BF is the key to the formation of BF, and the Quorum sensing (QS) system is the key to the study of BF regulation in multispecies. The first part has proved that S. mitis can enhance the adhesion of PAO1 and the formation of BF, but the specific mechanism is unclear; and P. aeruginosa QS system is closely related to its adhesion and BF formation ability. So, is S. mitis related to P. aeruginosa QS system? Group R, P.a_Las R_rhl R, S.mitis, PAO1+S.mitis, P.a_las R+S.mitis, P.a_Las R RHL R+S.mitis, P.a_Las R RHL R+S.mitis, crystal violet, plate counting and optical microscopy were used to observe bacterial adhesion, crystal violet, plate counting and laser confocal microscopy (CLSM) were used to observe the formation of BF. Results: The adhesion of PAO1+S.mitis, P.a91las R+S.mitis, P.a91las R+S.mitis, P.a91LasR91rhl R+S.mitis, P.a91R+S.mitis three groups were significantly stronger than PAO1 alone, P.a91lasR and P.a91lasR and P.a91LasR91rhl R group (P 0.05); and the plate count results showed that PAO1+S.mitis, P.a91las R+S.mitis, P.a91las R+S.las, P.a91las R+S.las, P.a91R+S.las, P.a91las, P.A91The adhesion of P. aeruginosa in RHL R + S. mitis mixed group was higher than that in RHL R + S. mitis mixed group. BF biomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomabiomaDifference (P 0.05). S. mitis could up-regulate the QS gene of PAO1 strain The expression of QS gene (including Las I, Las R, RHL I, RHL R, RHL I, RHL R) was significantly higher than that of PAO1 group (P 0.05), but there was no significant difference between P.a91las R+S.mitis group and P.a91las R+S.mitis group and P.a91las R91rhl R+S.mitis group (including Las I, Las R, RHL I, RHL R, RHL I, RHL R) and P.a91las91las91las91las R and P.a91Rmitmitmitmitmitaerl group (P 0.05). Conclusion: for P.a91las91las91las91rasrasrasrasrasrasrasadhesion force S. mitis promotes BF formation by up-regulating the P. aeruginosa QS gene. Whether this mechanism is directly mediated by S. mitis or whether certain substances (such as AI-2) secreted by S. mitis play a role in the formation of P. aeruginosa BF remains to be demonstrated by future experiments.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.991

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本文編號(hào)：2204841