【摘要】：研究背景原發(fā)性肝癌是我國及某些亞非地區(qū)的常見癌癥,也是我國最常見的惡性腫瘤之一。目前手術切除仍被認為是首選的治療方法,但由于80%以上的肝癌患者伴有肝硬化,使肝切除量受到一定程度的限制。而且一些肝癌生長的部位靠近第一、第二、第三肝門,給手術切除帶來很大困難,因而在臨床上可手術切除的病人不足總數(shù)的20%。經(jīng)導管肝動脈化療栓塞術(transcatheter hepatic arterial chemoembolization, TACE)是臨床上治療肝癌的主要方法之一。然而,在我們的臨床實踐中,肝癌TACE術后的遠期療效仍不理想,術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍非常高,且復發(fā)和轉(zhuǎn)移是導致肝癌患者死亡的主要因素。其原因現(xiàn)已基本查明,TACE術后因肝癌組織缺血、缺氧會導致血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達上調(diào)。而VEGF是目前已知作用最強和最專一的刺激內(nèi)皮細胞增生的因子之一,它也是已知最強的血管滲透劑,比組織胺作用大5萬倍。VEGF可增加微血管、特別是毛細血管后靜脈和小靜脈的通透性,促進血管滲漏。因此,VEGF表達程度反映腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管構(gòu)建水平,直接反映了腫瘤生長的速度和轉(zhuǎn)移的傾向。要降低肝癌TACE術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移率,提高患者生存率,就必須阻斷VEGF的信號傳導路徑,降低VEGF的表達水平,從而阻止腫瘤新生血管的形成。因此,臨床迫切需要將TACE技術與某種靶向VEGF的抗腫瘤血管生成的基因治療策略相結(jié)合。而RNA干擾(RNA interference, RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),為本研究提供了科學的理論依據(jù),也是目前腫瘤治療學領域中的研究熱點。RNA干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象是近年來RNA研究領域的一個重要的發(fā)現(xiàn)。RNAi是一種高度序列特異性的保守轉(zhuǎn)錄后基因沉默,它是由小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)誘導引起的同源性基因抑制。隨著對siRNA相關研究的不斷深入,越來越多的研究顯示了siRNA用于基因治療的潛在優(yōu)勢,科學家們開始探索其用于基因治療的可能性。研究表明siRNA可以阻斷或下調(diào)目標基因的表達,其誘導的基因沉默具有高度的特異性以及投入少、周期短、操作簡單等優(yōu)勢,因此極有可能成為新一代的治療性藥物,具有廣闊的應用前景。早期國內(nèi)外學者利用RNAi技術,對卵巢癌、惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌、胃癌等靶向性抑制VEGF的研究結(jié)果表明具有高效抑制腫瘤血管生成,但該類研究絕大多數(shù)尚局限于體外實驗。自從2002年McCaffrey等首次發(fā)表了小鼠模型siRNA成功抑制目標基因的體內(nèi)研究后,一些不同的研究團隊也在各種動物模型中利用RNAi技術特異性地抑制了一些惡性腫瘤如肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤靶向基因的表達。這些體內(nèi)siRNA實驗的成功引起了對以發(fā)展RNA干擾為基礎的治療學上的廣泛關注。2006年美國OPKO公司首次研發(fā)的靶向治療年齡相關性黃斑變性患者的藥物(商品名：Bevasiranib)問世并進入臨床試驗階段,這種藥物即是以VEGF基因為靶向的siRNA。RNAi技術從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在很短的時間內(nèi)迅速從體外細胞、動物試驗發(fā)展到臨床試驗,充分展示了它的優(yōu)越性。以siRNA為基礎的RNAi技術因為其基因沉默的高度特異性、高效性和安全性,為疾病的基因治療開辟了新的途徑。RNAi技術作為肝細胞肝癌(hepatocelullar carcinoma, HCC)基因治療策略的研究也是當前較為活躍的研究熱點之一。目前,RNAi技術應用于HCC的研究有：1.針對HCC發(fā)生的免疫監(jiān)視機制的研究：如人類白細胞抗原-G基因(human leucocyte antigen-G, HLA-G)在肝癌組織中異常高表達,其被認為是肝癌細胞得以逃脫宿主免疫監(jiān)視的手段。研究學者構(gòu)建針對HLA-G基因的shRNA真核表達質(zhì)粒pGUP-GFP-Neo-HLA-G并轉(zhuǎn)染于HCC Huh7細胞系后,HLA-G表達水平明顯下調(diào)。與自然殺傷細胞NK-92MI細胞共同培養(yǎng)后,可檢測到NK細胞對轉(zhuǎn)染HLA-G shRNA的Huh7細胞殺傷作用明顯升高。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后Huh7細胞表達HLA-G基因下調(diào)后,NK細胞對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視功能加強,從而可降低腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的可能。2.針對HCC細胞增殖的研究：Salvi等通過RNA干擾技術沉默尿激酶性纖溶酶原激活劑(urokinase type plasminogenactivator, uPA)在HCC細胞中的表達后,能明顯抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長。因此發(fā)現(xiàn)uPA與細胞的增殖有很重要的關系,并認為uPA有可能作為HCC治療的分子靶點。細胞分裂周期調(diào)控磷酸酶(cell division cycle, CDC) 25B可正性調(diào)控細胞周期依賴蛋白激酶,促進細胞有絲分裂和增殖,在HCC組織中高表達。Yan等以CDC 25B-siRNA轉(zhuǎn)染Hep40肝癌細胞后,CDC 25B表達抑制率達90%,使肝癌細胞阻滯于G2期,明顯抑制了Hep40肝癌細胞在裸鼠中的生長。3.針對HCC侵襲和轉(zhuǎn)移的研究：骨橋蛋白(osteopontin, OPN)在許多高轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤如HCC中高表達,OPN與受體結(jié)合能促進細胞增殖和遷移、浸潤。Cheng等針對OPN設計shRNA并轉(zhuǎn)染肝癌細胞后,OPN表達明顯下調(diào),HCC細胞生長、黏附和侵襲能力均被抑制,轉(zhuǎn)染細胞在裸鼠中的成瘤性和肺轉(zhuǎn)移能力均下降。Guo等篩選了肝癌轉(zhuǎn)移潛能不斷遞增的3株肝癌細胞,用DNA芯片技術檢測到這些細胞株隨著轉(zhuǎn)移能力的增加,蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)β表達也增加,但當用RNAi技術沉默PKCβ后,肝癌細胞株的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能明顯降低,由此結(jié)果表明PKCβ在肝癌遷移過程中的作用。4.針對HCC治療相關的研究：其一是聯(lián)合放射治療增敏的研究。DNA雙鏈斷裂修復基因(DNA damage repair protein 51, RAD51)是DNA修復系統(tǒng)的重要成員之一,它可通過同源重組來修復由于電離輻射等原因造成的DNA損傷,當細胞受到基因毒性藥物(如絲裂霉素C)、紫外線或電離輻射的損害時,RAD51蛋白會聚集到DNA斷裂處尋找同源序列來修復。RAD51基因在多種不同的腫瘤細胞(如宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌等)中過度表達,表現(xiàn)為細胞核局部RAD51蛋白聚集,mRNA水平升高。研究表明該基因的過度表達能增強腫瘤細胞對電離輻射以及化療藥物的耐受力。研究者將靶向RAD51基因的siRNA轉(zhuǎn)染至人HCC的HepG2細胞株中發(fā)現(xiàn),siRNA可抑制腫瘤細胞RAD51基因的表達,HepG2細胞對放療的敏感性明顯增強,表明靶向RAD51基因RNAi技術可作為惡性腫瘤放射增敏治療的基因干預策略。其二是聯(lián)合化療抑制多藥耐藥基因的研究。同樣,多藥耐藥基因(multi-drug resistance 1, MDR1)在多種惡性腫瘤如白血病、肺癌、胃癌、HCC等細胞中高表達。大多數(shù)的化療藥物如5-Fu、順鉑、表阿霉素等對HCC治療不敏感,單藥有效率不足20%。研究者設計靶向MDRl的siRNA轉(zhuǎn)染至HCC細胞MHCC97H細胞株后,明顯下調(diào)MDR1 mRNA和蛋白的表達,MTT法分析結(jié)果表明MHCC97H肝癌細胞對5-Fu、長春新堿、阿霉素的敏感性明顯提高。生存素基因(survivin)也與HCC耐藥有關,研究者裸鼠皮下種植耐阿霉素的SMMC7721細胞株后,通過RNAi技術向皮下成瘤的裸鼠瘤體內(nèi)注射靶向survivin的siRNA后,腫瘤組織survivin表達明顯下調(diào),腫瘤對阿霉素化療藥物敏感性提高,腫瘤體積較對照組明顯縮小。然而,由于siRNA分子質(zhì)量較大(14000u左右),且?guī)в写罅控撾姾?一般無法順利穿越細胞膜到達細胞內(nèi),容易從腎臟排出。另外,siRNA自身的不穩(wěn)定性、易被降解、半衰期短、易引起免疫反應等因素導致siRNA的生物利用度降低,影響其臨床應用。由于活體腫瘤細胞的生存環(huán)境和基礎條件復雜,有關RNAi技術應用于活體實驗的報道多數(shù)局限于體表臟器或腫瘤局部注射,經(jīng)靜脈注射靶向siRNA分子治療腫瘤的動物實驗研究表明多具有藥物毒性反應大、靶器官局部藥物濃度低的缺點。隨著研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn),如何把siRNA導入試驗動物或是人體內(nèi)成為該技術進一步推廣應用的瓶頸,也是限制RNAi得以廣泛應用的主要障礙。如何提高siRNA轉(zhuǎn)染效率,維持在體內(nèi)的有效濃度,提高抑制效率,提高安全性成為科研工作者和臨床醫(yī)師迫切關注的問題。為了充分發(fā)揮RNAi的技術優(yōu)勢又能克服其傳輸上的缺點,本研究利用介入治療技術的優(yōu)勢和肝癌腫瘤細胞對碘油的親和性,通過導管超選至腫瘤供血動脈直接灌注靶向VEGF-siRNA與碘油的乳化劑,進而觀察其對活體腫瘤的抑制作用。本研究將靶向VEGF siRNA的抗腫瘤血管生成的基因治療策略與肝癌肝動脈插管化療的TAE治療技術相結(jié)合,通過下調(diào)肝癌患者TAE術后VEGF的表達,阻斷其腫瘤血管生成的通路,達到降低肝癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移率,提高肝癌患者生存率的目的。本研究充分考慮了RNAi的特異性和高效性的基因治療優(yōu)勢和經(jīng)動脈插管化療的藥物傳送優(yōu)勢,彌補兩者各自的劣勢,相輔相成,充分發(fā)揮兩者在抗腫瘤治療中的協(xié)同作用。本研究既建立在相關體外實驗的理論基礎和研究成果上,又能克服RNAi技術傳輸難點、靶器官局部藥物濃度低、全身藥物毒性反應大的缺點。國內(nèi)外目前尚未見此類研究報道。研究方法1. 細胞培養(yǎng)：兔VX2細胞株。2. 靶向VEGF siRNA分子設計及合成：結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫和設計軟件設計19nt的靶向VEGF-siRNA.3. siRNA分子轉(zhuǎn)染：按Lipofectamin 2000TM試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。4. 細胞增殖活力檢測：MTT法檢測。5. RT-PCR半定量法檢測VEGF mRNA水平：體外實驗檢測轉(zhuǎn)染后VX2細胞VEGF mRNA表達水平。6. ELISA法檢測分泌性VEGF蛋白含量：體外實驗檢測轉(zhuǎn)染后VX2細胞分泌VEGF蛋白含量。7. 實驗兔VX2肝癌模型的建立：傳代VX2腫瘤細胞移植于新西蘭大白兔左肝,飼養(yǎng)3周。8. 肝癌模型螺旋CT掃描：TACE術前1 d及術后28 d荷瘤兔行肝臟平掃及三期增強掃描,影像學方法評估肝內(nèi)腫瘤生長情況。9. 實驗兔分組及TACE實施：30只荷瘤兔被隨機分成三組并按設計方法行TACE術。10. CT掃描檢測肝臟腫瘤體積和腫瘤生長率：觀察碘油沉積情況并采集影像學數(shù)據(jù)分析肝臟移植瘤的體積,并計算腫瘤的生長率。11. 病理學檢查和免疫組織化學染色：常規(guī)病理學檢查采用HE染色；VEGF及CD34免疫組織化學染包均采用通用型二步法；對VEGF陽性染色及MVD計數(shù)。12. 腫瘤組織RT-PCR檢測及Western blotting檢測：RT-PCR檢測腫瘤組織VEGF mRNA的表達；Western blotting檢測腫瘤組織VEGF蛋白的表達。13. 腫瘤細胞凋亡檢測：采用流式細胞技術,Annexin V/PI雙染法檢測腫瘤細胞凋亡。14. 肝、腎毒性檢測：術前1 d、術后7 d和28 d采耳緣靜脈血,自動生化分析儀測量AST、ALT和血尿素氮、血肌酐水平。結(jié)果1. siRNA轉(zhuǎn)染VX2細胞48h后的細胞生長活力結(jié)果顯示：VEGF-sil轉(zhuǎn)染和VEGF-si3轉(zhuǎn)染對VX2細胞生長的抑制率顯著高于scr-siRNA轉(zhuǎn)染對VX2細胞生長的抑制率(P0.01)提示靶向VEGF基因的2條siRNA分子(VEGF-sil或VEGF-si3)能夠有效抑制VX2細胞生長。2. VEGF-sil轉(zhuǎn)染組和VEGF-si3轉(zhuǎn)染組VX2細胞的VEGF mRNA表達水平分別為(0.37±0.06)和(0.45-4-0.07),均顯著低于未轉(zhuǎn)染組以及scr-siRNA轉(zhuǎn)染組,靶向VEGF基因的2條siRNA分子(VEGF-sil或VEGF-si3)能夠特異地降低VX2細胞VEGF mRNA表達水平。3. VEGF-sil和VEGF-si3轉(zhuǎn)染組對VX2細胞分泌VEGF蛋白的抑制率分別為(58.1-4-7.3)%和(51.9士7.9)%,顯著高于scr-siRNA轉(zhuǎn)染組對VX2細胞分泌VEGF蛋白的抑制率(3.2士0.7)%,P均0.01。靶向VEGF基因的2條siRNA分子(VEGF-si1或VEGF-si3)能夠特異地下調(diào)VX2細胞分泌VEGF蛋白。4. 肝癌模型兔腫瘤經(jīng)TACE治療后,CT顯示腫瘤周邊富血管區(qū)域碘油存積,腫瘤中央壞死明顯。5. 術后28d高劑量組、低劑量組的腫瘤生長率分別為36.09±15.73%、79.67-4-19.63%,均小于對照組(155.18±19.42%)(P0.05)。6. 術后28 d高劑量組、低劑量組腫瘤MVD(21.4士10.6與34.1士12.0)均小于對照組(57.9-4-16.1),VEGF表達的陽性細胞計數(shù)分別為102.15±18.33、67.40-±12.32和36.25±10.88。差別均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7. 術后高劑量組和低劑量組腫瘤組織VEGFmRNA和VEGF蛋白的相對表達量較對照組都有明顯降低,且其抑制效率隨藥物濃度的增加而增強。8. 術后高劑量組和低劑量組腫瘤組織細胞發(fā)生凋亡率明顯高于對照組,表明VEGF-siRNA能通過誘導細胞凋亡而抑制腫瘤生長。9. 經(jīng)TACE技術傳送VEGF-siRNA不僅對肝腎無明顯毒性反應,而且能抑制腫瘤弓I起的肝損害作用。結(jié)論1. 設計并篩選出最佳靶向VEGF基因的siRNA分子能在體外特異地抑制兔鱗狀上皮細胞癌細胞系VX2細胞的VEGF基因轉(zhuǎn)錄、VEGF蛋白分泌以及VX2細胞增殖。2. 在體實驗靶向VEGF-siRNA能特異性地抑制兔VX2肝腫瘤的血管生成,促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤的生長。3. 經(jīng)肝動脈插管灌注VEGF-siRNA碘油乳化劑能有效地傳送siRNA進入體內(nèi)發(fā)揮作用,為RNAi技術在肝癌治療的傳送途徑開拓新思路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7;R-332

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本文編號：2149520