【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一種慢性傳染性疾病,一直危害著人類健康。全球有三分之一的人已經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌,有10%的人將可能在以后發(fā)展成為結(jié)核病。2015年全球新發(fā)結(jié)核病例有1040萬,死于結(jié)核病的人數(shù)有140萬人。近年來,隨著新發(fā)結(jié)核耐藥株和HIV/AIDs合并感染病例的增多,導致結(jié)核病的發(fā)病率增高、全球結(jié)核病負擔日益加重,盡管從2000年到2015年,結(jié)核病引起的死亡率已經(jīng)下降了 22%,結(jié)核病仍然位居引起人類死亡的十大病因之首。目前,卡介苗(BCG)仍然是全球范圍內(nèi)唯一獲準廣泛使用的用于抵抗結(jié)核病的疫苗。BCG是牛結(jié)核分枝桿菌經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)而得到的一種減毒活疫苗。雖然BCG疫苗對預防兒童中栗粒型結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎等有較佳的效果,但BCG對成人結(jié)核病的保護率存在有很大差別,在0～80%之間,且BCG只能有效地預防原發(fā)性結(jié)核病。研究發(fā)現(xiàn)不同BCG疫苗株之間隨著保護性抗原或者表位的丟失而導致不同的BCG株保護性差異,我們需要研發(fā)新的疫苗為更好控制結(jié)核病提供新的手段,因此我們需要尋找新的免疫優(yōu)勢抗原或在表位,將其用于研制重組BCG或者用于BCG接種后的加強免疫型新型疫苗。在本研究中,我們結(jié)合基因組學和生物信息學技術對H37Rv蛋白質(zhì)組上的蛋白抗原進行篩選,將篩選出的蛋白抗原進行T細胞表位預測,選取預測中得分值較高的表位,對這些表位多肽進行合成。收集肺結(jié)核患者、肺部其他疾病患者和健康志愿者的外周血淋巴細胞,用多肽作為刺激原,進行進行伽馬干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay,IGRA),從而篩選出結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原或者表位。選取陽性率較高的抗原表位,與佐劑DDA和polyI:C乳化后免疫BALB/c小鼠,檢測相應抗原刺激后的脾細胞上清中的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的濃度,同時檢測血清中的IgG、IgG1和IgG2a抗體滴度。用流式}0胞儀檢測CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞的比例,對這些表位的免疫原性進行評價。利用seppa2.0對B細胞表位預測,合成表位B細胞表位多肽,并利用肺結(jié)核患者和健康志愿者的血清對這些B細胞表位進行血清學評價。另外,本實驗制備的重組蛋白Rv2351c,本研究中利用IGRA實驗和動物實驗對Rv2351c的診斷性能和免疫效果進行了評價。最終,我們共對H37Rv基因組上273個抗原的2726個T細胞表位和B細胞表位進行了預測,從中選取了來自13個抗原的265個人T細胞表位多肽和來自3個抗原的22條人B細胞抗原表位多肽進行合成。我們通過IGRA鑒定出了具有抗原性30個人T細胞抗原表位多肽,分別來自于13個結(jié)核抗原:Rv3793、Rv05 85c、Rv1490、Rv0446c、Rv 1547、Rv2201、Rv3573、Rv0197、Rv0674、Rv1566c、Rv1798、Rv2318和Rv2941。這些多肽的反應靈敏度在1.9%～30%之間,特異性在96.81%～100%之間。位于同一個抗原的多肽聯(lián)合診斷后,單個抗原的反應靈敏度可達到1.9%～50%。Rv2351c蛋白的靈敏度為61.7%,特異度為91.4%。在動物實驗中,11條多肽和Rv2351c蛋白均能誘導產(chǎn)生不同程度的細胞免疫應答。其中 P1(Rv3793)、P24(Rv0585c)、P26(Rv0585c)、P55(Rv1490)、P120(Rv0446c)、P121(Rv0446c)和 Rv2351c 主要誘導產(chǎn)生 Th1 和 Th2 混合型細胞免疫應答,P123(Rv0446c)、P136(Rv2201)、P166(Rv0197)、P309(Rv1798)和P318(Rv2318)多肽主要產(chǎn)生Th1型細胞免疫應答。與對照組相比,多肽P1(Rv3793)、P26(Rv0585c)、P120(Rv0446c)和 P121(Rv0446c)能引起小鼠體內(nèi) CD3+CD4+T 細胞的比例升高,多肽有 P123(Rv0446c)、P166(Rv0197)、P309(Rv1798)、P318(Rv2318)和 Rv2351c 蛋白均能引起小鼠體內(nèi) CD3+CD8+T細胞的比例顯著升高,P24(Rv0585c)、P55(Rv1490)和 P136(Rv2201)能夠同時引起CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞的比例同時升高。這11條多肽誘導產(chǎn)生的IgG抗體的滴度從1:44～1:5079不等,其中P121(Rv0446c)和P166(Rv0197)能夠引起1:1000以上的IgG抗體滴度。Rv2351c引起IgG的抗體滴度達到1:2.2×106。Rv0674的9條B細胞表位多肽的反應靈敏度在54.55%～79.55%,特異度在71.25%～95%,除P203、P204以外,其他多肽的ROC曲線下面積均大于0.8。Rv1411c的7條多肽的反應靈敏度在46.5%～88.6%,特異度在75%～92.5%。Rv1477的6條多肽反應靈敏度為60.23%～76.14%,特異度在86.25%～95%。除了 P220之外,且ROC曲線下面積均在0.8以上。本研究成功鑒定的來自14個新結(jié)核抗原30個人T細胞表位和Rv2351c蛋白具有一定的抗原性,動物實驗結(jié)果證實其中11條T細胞表位多肽和Rv2351c蛋白在小鼠體內(nèi)能引起細胞免疫應答和體液免疫應答,具有一定的免疫原性。本研究對3個新抗原的22條人B細胞表位進行了血清學評價,結(jié)果證實這22條B細胞表位具有一定的血清學診斷價值。綜上所述,本研究鑒定出來16個結(jié)核分枝桿菌新抗原,為結(jié)核病的診斷和疫苗的研究提供了一定的基礎。
[Abstract]:Tuberculosis is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB), which has been harmful to human health. 1/3 of the people all over the world have infected Mycobacterium tuberculosis, and 10% of them will be likely to develop into TB.2015 for 10 million 400 thousand of the global new tuberculosis cases in the future and die from tuberculosis. There are 1 million 400 thousand people. In recent years, with the increase of new TB drug resistant strains and HIV/AIDs combined infection cases, the incidence of tuberculosis increases and the global tuberculosis burden is increasing. The death rate of tuberculosis has fallen by 22% from 2000 to 2015, and nuclear disease remains the ten major cause of human death. First. At present, BCG is still the only widely used vaccine to resist tuberculosis worldwide..BCG is a live attenuated vaccine obtained by continuous subculture of Mycobacterium tuberculosis. Although the BCG vaccine has a better effect on preventing chestnut tuberculosis and tuberculous meningitis in children, the BCG against adult The protection rate of nuclear disease is very different, between 0 and 80%, and BCG can only effectively prevent primary tuberculosis. The study found that different BCG vaccine strains with the loss of protective antigens or epitopes cause different protective differences of BCG strains. We need to develop new vaccine to provide new means to better control tuberculosis. We need to find new immune dominant antigens or in epitopes for the development of recombinant BCG or a new type of immunized vaccine after BCG inoculation. In this study, we screened the protein antigens on the H37Rv proteome by combining the genomics and bioinformatics techniques, and the selected protein antigens were used for the T cell table. Interferon gamma release assay (IGRA) was used to screen out tuberculosis scores. The immunodominant antigen or epitope of the Mycobacterium was selected. The antigen epitopes with higher positive rate were selected and the BALB/c mice were immunized with the adjuvant DDA and polyI:C. The concentrations of IFN- gamma, IL-2, IL-4 and IL-10 in the splenocytes supernatant after the corresponding antigen stimulation were detected, and the serum IgG, IgG1 and IgG2a antibody titers in the serum were detected. The CD3+CD4+T was detected by flow}0 cytometer. The immunogenicity of these epitopes was evaluated by the ratio of the cells to the CD3+CD8+T cells. The epitopes of the epitopes of the epitopes of the epitopes of the epitopes were synthesized by using seppa2.0 to predict the epitopes of the B cells, and the serological evaluation of these B cell epitopes was carried out with the serum of the patients with pulmonary tuberculosis and healthy volunteers. In addition, the recombinant protein Rv2351c, prepared in this experiment, was studied in this study. The diagnostic and immune effects of Rv2351c were evaluated by IGRA and animal experiments. Finally, we predicted the 2726 T cell epitopes and B cell epitopes of 273 antigens on the H37Rv genome, and selected 265 T cell epitopes from 13 antigens and 22 human B cell antigen tables from 3 antigens. We identified 30 T cell antigen epitopes with antigenicity by IGRA, which were derived from 13 TB antigens: Rv3793, Rv05 85C, Rv1490, Rv0446c, Rv 1547, Rv2201, Rv3573, Rv0197, and the sensitivity of these peptides was between 1.9% and 30%, and the specificity was 96.81% To 100%. After the combined diagnosis of the same antigen, the sensitivity of the single antigen can reach 1.9% ~ 50%.Rv2351c protein sensitivity 61.7%. The specificity is 91.4%. in animal experiments, 11 polypeptide and Rv2351c protein can induce different degree of cellular immune response. Among them, P1 (Rv3793), P24 (Rv0585c), P26 (Rv05) 85C), P55 (Rv1490), P120 (Rv0446c), P121 (Rv0446c) and Rv2351c are mainly induced to produce a mixed cell immune response of Th1 and Th2. 446c) can cause an increase in the proportion of CD3+CD4+T cells in mice. The peptide has P123 (Rv0446c), P166 (Rv0197), P309 (Rv1798), P318 (Rv2318) and Rv2351c protein, which can cause a significant increase in the ratio of CD3+CD8+T cells in mice. At the same time, the titers of the IgG antibodies induced by these 11 peptides ranged from 1:44 to 1:5079, of which P121 (Rv0446c) and P166 (Rv0197) could cause the IgG antibody titer above 1:1000 to cause the antibody titer of IgG to the 1:2.2 * 106.Rv0674 9 cell epitopes of 54.55% to 79.55% and the specificity of 71.25% To 95%, in addition to P203 and P204, the sensitivity of the 7 peptides with areas larger than 0.8.Rv1411c under ROC curves of other peptides is 46.5% to 88.6%, and the sensitivity of 6 peptides with specificity of 75% to 92.5%.Rv1477 is 60.23% to 76.14%, the specificity is 86.25% to 95%. except P220, and the area under ROC curve is more than 0.8. The success of this study is successful. 30 T cell epitopes and Rv2351c proteins from 14 new TB antigens have a certain antigenicity. Animal experimental results confirm that 11 T cell epitopes and Rv2351c proteins can cause cellular immune response and humoral immune response in mice, and have a certain immunogenicity. This study on 22 people of 3 new antigens B thin. The cell epitopes were evaluated by serology. The results showed that the 22 B cell epitopes had a certain value of serological diagnosis. To sum up, 16 new Mycobacterium tuberculosis antigens were identified in this study, which provided a basis for the diagnosis of tuberculosis and the study of vaccines.
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R378.911

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本文編號：2145181