【摘要】：獎賞效應(yīng)是機(jī)體趨利避害、保證個體生存和種族延續(xù)的重要機(jī)制之一。腦內(nèi)的獎賞通路由中腦邊緣皮質(zhì)多巴胺系統(tǒng)構(gòu)成。該通路始于中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)的多巴胺(DA)能神經(jīng)元,其神經(jīng)纖維上行,經(jīng)內(nèi)側(cè)前腦束投射至伏隔核(NAc)、海馬(Hippo)、內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mPFC)、杏仁核(Amg)等腦區(qū),是目前公認(rèn)的調(diào)節(jié)獎賞效應(yīng)的公共通路。研究發(fā)現(xiàn)各類成癮性物質(zhì)均能直接或間接的激活上述獎賞中樞,誘導(dǎo)DA濃度升高,產(chǎn)生獎賞效應(yīng);在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步產(chǎn)生與藥物獎賞作用相關(guān)的關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)記憶,進(jìn)而誘導(dǎo)強(qiáng)迫性用藥行為的出現(xiàn),最終導(dǎo)致成癮的形成。然而,成癮性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后,除會作用于獎賞中樞產(chǎn)生上述獎賞效應(yīng)和成癮外,還會同時作用于其他腦區(qū),引起多種復(fù)雜神經(jīng)遞質(zhì)的變化和復(fù)雜神經(jīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)功能的改變。中腦邊緣皮質(zhì)DA系統(tǒng)在藥物成癮過程中扮演怎樣的角色,對藥物成癮的產(chǎn)生有怎樣直接的貢獻(xiàn)尚沒有足夠的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。采用傳統(tǒng)的藥理學(xué)、腦區(qū)損毀及電生理等實(shí)驗(yàn)技術(shù),無法在空間和時間上特異精確解析特定神經(jīng)元及單投射通路的作用。新興的光遺傳學(xué)技術(shù)能夠克服這一瓶頸,可在動物清醒自由活動的狀態(tài)下,研究瞬時激活或者抑制單神經(jīng)元、單投射對于行為的調(diào)控作用。采用該技術(shù),能夠精確分析中腦邊緣皮質(zhì)DA系統(tǒng)在獎賞中所發(fā)揮的作用。這方面的精確解析不但對認(rèn)識成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制具有重要意義,還會為評價和研究藥物成癮性及藥物對成癮的影響與DA系統(tǒng)的關(guān)系建立更為靈敏的實(shí)驗(yàn)動物模型提供新的策略,為大麻等弱精神活性物質(zhì)的獎賞效應(yīng)評價和機(jī)制研究提供有效技術(shù)手段。目前,大麻是在全球范圍內(nèi)濫用最為嚴(yán)重的精神活性物質(zhì)。造成這一現(xiàn)狀的根本原因是吸食大麻能給吸食者帶來欣快感、幸福感和放松感等正性強(qiáng)化效應(yīng)。大麻產(chǎn)生上述精神效應(yīng)的主要成分是四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)。THC進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后主要作用于大麻素受體1(Cannabinoid Receptor Type 1,CB1R)。CB1R是與Gi偶聯(lián)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CB1R主要表達(dá)在γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神經(jīng)元上。THC作為CB1R的激動劑,當(dāng)其與CB1R結(jié)合后,即可激活該受體,從而抑制了GABA能神經(jīng)元的活性,解除GABA能神經(jīng)元對DA能神經(jīng)元的抑制,增強(qiáng)了后者的興奮性,最終產(chǎn)生欣快效應(yīng)。雖然,大麻是當(dāng)今世界上濫用最為廣泛的精神活性物質(zhì),但在動物實(shí)驗(yàn)中大麻致成癮潛能尚無定論。在評價成癮的金標(biāo)準(zhǔn)模型——自身給藥實(shí)驗(yàn)中,僅一家實(shí)驗(yàn)室,僅在非人靈長類動物(松鼠猴)成功建立了THC自身給藥行為模型。在嚙齒類動物條件性位置偏愛模型(Conditioned Place Preference,CPP)和顱內(nèi)電刺激模型((Intracranial self-stimulation,ICSS)上評價THC的成癮潛能時,其研究結(jié)果相互矛盾。那么,究竟是何原因?qū)е吕碚摵蛯?shí)踐如此大的不同呢?首先,大麻的致成癮潛能較其他經(jīng)典毒品(可卡因和海洛因)及合成毒品(甲基苯丙胺)相對較低;其次,對于大麻作用的主要靶點(diǎn)CB1R的研究而言,以往主要采用放射自顯影,原位雜交或電生理的技術(shù)手段來確定其在腦內(nèi)的表達(dá)分布,而以上技術(shù)手段由于操作繁雜,結(jié)果較大程度受限于信噪比的影響,無法精確實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞類型共定位,導(dǎo)致對于結(jié)果的解釋存在一定的局限性和不完整性。例如,多數(shù)研究結(jié)果集中于報道CB1R表達(dá)水平較高的腦區(qū),如海馬,皮層等的GABA能神經(jīng)元上,對于在獎賞作用中扮演重要作用的VTA腦區(qū)的CB1R表達(dá)情況鮮有涉及,而且對于其在與成癮行為密切相關(guān)的其他神經(jīng)元(DA能神經(jīng)元)的表達(dá)也尚無明確結(jié)論。此外,THC作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)后,可能誘發(fā)多種神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的改變,目前的動物模型無法在時間和空間中精確分析該物質(zhì)對單一的DA獎賞系統(tǒng)的影響作用。以上問題,導(dǎo)致了對大麻的正性強(qiáng)化作用及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制認(rèn)識的局限性。闡明這些問題不但對人類準(zhǔn)確認(rèn)識大麻的成癮潛能具有重要意義,還有利于我們對成癮機(jī)制的全面認(rèn)識。在歐美國家出現(xiàn)大麻合法化傾向的今天顯得尤為重要�；谝陨蠁栴},本文采用光遺傳技術(shù)對中腦邊緣皮質(zhì)DA系統(tǒng)對獎賞效應(yīng)的精確調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究,成功建立了自給光模型;以此為基礎(chǔ),研究了大麻對獎賞系統(tǒng)的作用及可能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。本研究的主要發(fā)現(xiàn)如下。一、中腦邊緣皮質(zhì)多巴胺系統(tǒng)直接參與獎賞效應(yīng)的調(diào)控(一)特異性激活腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元能夠建立自給光行為為了特異性的研究DA神經(jīng)元的正性強(qiáng)化作用,本文采用了DAT-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,將帶有興奮性光敏蛋白(ChR2)的腺相關(guān)病毒(AAV-DIO-Ch R2-mCherry)微注射在VTA腦區(qū),使得光敏蛋白特異性的表達(dá)在DA能神經(jīng)元上,獲得了DAT-CreChR2模型小鼠。在此動物模型上,波長為473nm的藍(lán)色激光能特異性激活VTA腦區(qū)表達(dá)的腺相關(guān)病毒從而激活DA神經(jīng)元。1.病毒表達(dá)特異性與功能性確證在本實(shí)驗(yàn)中,對進(jìn)行立體定位注射病毒后的小鼠腦組織進(jìn)行連續(xù)切片和免疫熒光染色,可觀察到表達(dá)紅色熒光的病毒神經(jīng)元與DA神經(jīng)元高度重合,提示該病毒在VTA腦區(qū)DA能神經(jīng)元上能高特異性表達(dá),能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。對于已表達(dá)病毒的腦片進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在用不同頻率473nm的藍(lán)色激光刺激下,神經(jīng)元可發(fā)放與刺激頻率相應(yīng)的動作電位,證明此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)已被成功建立。2.自給光刺激模型建立2.1.刺激參數(shù)的選擇在本實(shí)驗(yàn)中,采用固定刺激時程(15 ms/pulse)和波長(473 nm),不同刺激頻率(1、5、10、20、25及50 Hz,)誘導(dǎo)DAT-CreChR2小鼠建立自給光刺激模型(oICSS)及相應(yīng)的頻率效應(yīng)曲線。結(jié)果表明,在上述刺激頻率下DAT-CreChR2小鼠的有效鼻觸次數(shù)隨刺激頻率增加而增加(n=9),呈現(xiàn)明顯的頻率依賴性;20Hz以下的單個光脈沖刺激都能誘導(dǎo)穩(wěn)定的動作電位發(fā)放(n=8)。此結(jié)果提示在特異性激活VTA的DA神經(jīng)元后可使DAT-CreChR2小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的正性強(qiáng)化行為。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文選擇20 Hz為實(shí)驗(yàn)刺激頻率,供后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究使用。2.2.顱內(nèi)自給光訓(xùn)練采用上述確定的刺激參數(shù)對VTA的DA能神經(jīng)元進(jìn)行刺激。對完成立體定位術(shù)后小鼠的VTA進(jìn)行固定頻率(20 Hz),每天60 min的自給光訓(xùn)練。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨訓(xùn)練次數(shù)的增加DAT-CreChR2小鼠有效鼻觸次數(shù)(與光刺激偶聯(lián)鼻觸)迅速增加。與無效鼻觸次數(shù)相比,從訓(xùn)練的第2天開始,有效鼻觸次數(shù)顯著升高(P0.01,n=9),表現(xiàn)出正性強(qiáng)化效應(yīng)。而對照組DAT-CremCherry無此反應(yīng)出現(xiàn)(P0.05,n=5)。以上結(jié)果提示利用光遺傳學(xué)技術(shù)能高效且特異性強(qiáng)的操控DA神經(jīng)元活動,具有時間和空間特異性;單純激活VTA的DA神經(jīng)元即可產(chǎn)生穩(wěn)定的獎賞效應(yīng)。同時建立的僅依賴DA系統(tǒng)的o ICSS行為,可以用于評價藥物對DA獎賞系統(tǒng)的影響。已知中腦邊緣皮質(zhì)DA系統(tǒng)是由始于VTA的DA神經(jīng)纖維上行經(jīng)內(nèi)側(cè)前腦束投射至NAc、Hippo、mPFC、Amg等腦區(qū)所構(gòu)成,那么激活DA系統(tǒng)所產(chǎn)生的獎賞效應(yīng),具體是由哪個或哪幾個投射通路所完成的呢?我們利用特異性刺激DA神經(jīng)元投射末梢的方法對此進(jìn)行研究。(二)腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺神經(jīng)元不同投射通路在獎賞效應(yīng)中的作用1.免疫熒光和逆向追蹤實(shí)驗(yàn)我們首先在VTA單側(cè)注射AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒,然后對腦組織進(jìn)行切片觀察,發(fā)現(xiàn)在伏隔核核區(qū)(NAc core)、伏隔核外殼(NAc shell)、下邊緣皮質(zhì)(IL)和前邊緣皮層(PL)均有紅色熒光的神經(jīng)纖維存在。接下來將逆向追蹤染料Retrobeads分別定位注射于上述腦區(qū),對VTA進(jìn)行染色觀察,發(fā)現(xiàn)VTA均有被標(biāo)記的紅色熒光表達(dá),且與DA神經(jīng)元的特異性染色標(biāo)志物酪氨酸羥化酶(TH)重合,結(jié)果確證了從VTA發(fā)出的DA神經(jīng)元投射到了上述腦區(qū)。2.腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元投射通路在獎賞中作用將刺激光纖分別植入NAc core、NAc shell、IL和PL,進(jìn)行光刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)與光刺激VTA相比,雖然在訓(xùn)練開始的前6天實(shí)驗(yàn)動物的有效鼻觸增加速度均較慢,但與無效鼻觸相比,NAc core組動物從訓(xùn)練第7天開始有效鼻觸出現(xiàn)顯著增加(P0.05,n=9);NAc shell組動物則從訓(xùn)練第12天開始與無效鼻觸相比出現(xiàn)顯著差異(P0.05,n=7);NAc core、NAc shell刺激的后3天有效鼻觸次數(shù)分別為179±36.2次(n=9)和159±42.2次(n=7),均顯著高于無效鼻觸,但均顯著少于刺激VTA時的有效鼻觸723±112次(n=9);2)刺激IL的DA能神經(jīng)元末梢后,從第10天開始,有效鼻觸顯著高于無效鼻觸(P0.05,n=7),后三天平均有效鼻觸次數(shù)為140±29.4次,顯著高于無效鼻觸28±10.3次(n=7);刺激PL的DA能神經(jīng)元末梢后,不能使實(shí)驗(yàn)動物出現(xiàn)顯著自給光行為,最后三天有效鼻觸次數(shù)為46±16.0,無效鼻觸為35±12.4(n=7),無顯著差異(P0.05,n=5)。以上結(jié)果提示,從VTA發(fā)出的DA神經(jīng)纖維在NAc core、NAc shell、IL的投射均參與到了獎賞過程,單獨(dú)刺激上述通路即可引起獎賞行為,盡管效應(yīng)較刺激VTA弱;在PL部位的投射與獎賞啟動無直接關(guān)聯(lián)。以往通過在體電生理記錄以及測定DA濃度的方式認(rèn)為NAc core只參與到了獎賞預(yù)期,只有shell才參與到獎賞正性刺激中,但我們的研究結(jié)果有力的證明刺激core和shell的DA能神經(jīng)纖維均可直接產(chǎn)生獎賞作用。另外,以往認(rèn)為mPFC的亞區(qū)主要參與決策與動機(jī)的調(diào)控,從我們的結(jié)果可看到IL也參與到了獎賞效應(yīng)中。由此,我們將獎賞系統(tǒng)中的各條通路剝離開進(jìn)行了研究,并初步闡明了它們在獎賞效應(yīng)中的作用,對獎賞異常相關(guān)疾病提供了更為精確的靶區(qū)。二、大麻正性強(qiáng)化作用及可能機(jī)制研究。以上研究結(jié)果提示,中腦邊緣皮質(zhì)DA系統(tǒng)直接參與獎賞行為的調(diào)控。那么外源性大麻素的主要成分四氫大麻酚(THC)是否會影響該系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的藥理學(xué)效應(yīng)呢?THC是否具有獎賞作用呢?本研究分別從行為學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)兩方面進(jìn)行了相關(guān)研究。(一)大麻受體1在腹側(cè)被蓋區(qū)的神經(jīng)元分布因?yàn)榇舐槭荏w1(CB1R)是THC在腦內(nèi)發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn),因此了解CB1R的表達(dá)分布,特別是其神經(jīng)元特異性分布的情況,則成為研究THC中樞作用的前提。通過免疫熒光技術(shù)和RNAscope技術(shù),對CB1R在VTA的神經(jīng)元特異性分布進(jìn)行探究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)用免疫熒光技術(shù)可以在VTA的神經(jīng)纖維水平上檢測到CB1R蛋白存在,但未能實(shí)現(xiàn)其與神經(jīng)元類型之間的準(zhǔn)確共定位;2)用RNAscope實(shí)驗(yàn)技術(shù)則發(fā)現(xiàn)在VTA,CB1R的mRNA特異性地表達(dá)在DA能神經(jīng)元、谷氨酸(Glu)能神經(jīng)元及GABA能神經(jīng)元的胞體上,提示CB1R可能在VTA的GABA能、Glu能和DA能神經(jīng)元上均有表達(dá)。在特異性表達(dá)各類神經(jīng)元的檢測中,其表達(dá)比例分別為GABA:99.8±0.2%、Glu:99.4±0.4%,DA:26.8±4.3%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次驗(yàn)證了在VTA腦區(qū)的GABA神經(jīng)元和Glu神經(jīng)元上有CB1R表達(dá),并且首次發(fā)現(xiàn)在VTA的DA神經(jīng)元上存在CB1R的mRNA表達(dá)。那么,DA能神經(jīng)元上表達(dá)的CB1R是如何影響DA能神經(jīng)元功能而實(shí)現(xiàn)THC作用的呢?于是,我們進(jìn)一步采用已建立的僅激活DA獎賞系統(tǒng)的o ICSS模型進(jìn)行行為學(xué)和機(jī)制的深入研究。(二)多巴胺能神經(jīng)元參與外源性大麻正性強(qiáng)化作用及其可能神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究1.多巴胺能神經(jīng)元參與外源性大麻正性強(qiáng)化作用——行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用DA能神經(jīng)元CB1R條件性敲除小鼠DA-CB1-/-和非敲除小鼠DA-CB1+/+對THC激活DA能神經(jīng)元上CB1R的作用開展了研究。由于THC無法在實(shí)驗(yàn)動物上建立自給藥模型,所以我們利用本文第一部分創(chuàng)建的oICSS模型研究THC與DA系統(tǒng)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)非敲除組與敲除組小鼠均腹腔分別給予可卡因(2 mg/kg、10 mg/kg)后,o ICSS反應(yīng)曲線呈劑量依賴性向左上方移動,曲線下面積(AUC)較給可卡因前均顯著增大(n=6,P0.01)。提示可卡因誘導(dǎo)DA釋放增多后增強(qiáng)了光刺激的獎賞效應(yīng);提示oICSS頻率效應(yīng)曲線和經(jīng)典的電刺激-ICSS曲線一樣可用于評價藥物的獎賞相應(yīng)以及致依賴潛能;2)非敲除組與敲除組小鼠均腹腔分別給予THC(1 mg/kg)后oICSS曲線均顯著左移(非敲除組:n=8,P0.01;敲除組:n=7,P0.01);在腹腔給THC 3 mg/kg后非敲除組小鼠oICSS曲線右移,AUC顯著降低(n=8,P0.01),而敲除組小鼠無顯著變化(n=7,P0.05);腹腔給予選擇性CB1R激動劑ACEA 3 mg/kg(n=8)后獲得了同上實(shí)驗(yàn)結(jié)果。提示(1)低劑量THC對自給光行為可產(chǎn)生興奮性作用(正性強(qiáng)化作用)。THC的此效應(yīng)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制不是通過直接作用于DA能神經(jīng)元發(fā)揮的,可能與其下調(diào)抑制性GABA能神經(jīng)元功能相關(guān);(2)當(dāng)劑量升高到3 mg/kg時,THC對自給光行為可產(chǎn)生抑制性作用,其機(jī)制可能是通過激活DA能神經(jīng)元上CB1R下調(diào)DA能神經(jīng)元功能實(shí)現(xiàn)的;3)非敲除組與敲除組小鼠均腹腔分別給予大麻素受體2(CB2R)特異性激動劑JWH-133(10 mg/kg)后對o ICSS曲線均無顯著影響(n=4,P0.05)。提示本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠺HC所發(fā)揮的作用與激活CB2R無關(guān);4)腹腔給藥THC 1、3、10 mg/kg后,3 mg/kg THC僅能使非敲除組小鼠自發(fā)活動顯著降低(n=8,P0.01),對敲除組小鼠自發(fā)活動無顯著影響;10 mg/kg THC能使敲除和非敲除兩組小鼠自發(fā)活動均顯著降低(n=8,P0.01)。提示3 mg/kg的THC對自發(fā)活動的降低作用可能是通過CB1R發(fā)揮的,高劑量10 mg/kg的THC對自發(fā)活動影響可能是大劑量THC對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非特異抑制作用引起的;5)在檢測活動能力的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中,腹腔給THC 3 mg/kg后,敲除和非敲除兩組小鼠活動能力均未受影響(n=5,P0.05)。提示3 mg/kgTHC減少實(shí)驗(yàn)動物自發(fā)活動可能是由于其降低基礎(chǔ)DA水平,引起厭惡性效應(yīng),實(shí)驗(yàn)動物主觀不愿意活動造成的。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示THC在低劑量(1 mg/kg,i.p.)下對實(shí)驗(yàn)動物有獎賞效應(yīng),該效應(yīng)可能不是通過THC直接作用在DA能神經(jīng)元上產(chǎn)生的,而是通過優(yōu)勢激活GABA能神經(jīng)元上的CB1R,下調(diào)GABA能神經(jīng)元功能,解除了后者對DA能神經(jīng)元的抑制,間接上調(diào)DA能神經(jīng)元功能引起的。中劑量(3 mg/kg)THC則呈現(xiàn)出致厭惡(抑制)效應(yīng),其機(jī)制很可能通過激活DA能神經(jīng)元上的CB1R,抑制DA能神經(jīng)元的興奮性,而降低了DA神經(jīng)遞質(zhì)的釋放引起的。本實(shí)驗(yàn)通過對特異性敲除小鼠的研究,首次發(fā)現(xiàn)DA神經(jīng)元上的CB1R直接參與了THC厭惡作用的調(diào)節(jié)。2.可能神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究——神經(jīng)化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)敲匆陨系耐普摯_實(shí)存在與之對應(yīng)的神經(jīng)機(jī)制嗎?在第一部分的研究中,我們已證實(shí)DA直接介導(dǎo)了獎賞效應(yīng),而NAc則是其發(fā)揮獎賞效應(yīng)的主要靶腦區(qū)。為了進(jìn)一步證明以上推論,我們采用清醒動物微透析技術(shù)進(jìn)行研究,在相同的干預(yù)條件下,觀察NAc內(nèi)的DA濃度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)非敲除組小鼠DA-CB1+/+腹腔給藥THC 1 mg/kg后,NAc的DA含量無顯著變化(n=7,P0.05);腹腔注射給予THC 3 mg/kg后,NAc腦區(qū)的DA濃度顯著降低。(n=6,P0.01);2)條件性敲除小鼠DA-CB1-/-腹腔給藥THC 1 mg/kg后,NAc腦區(qū)的DA濃度顯著升高(n=8,P0.01);腹腔注射給予THC 3 mg/kg后,NAc腦區(qū)DA濃度依舊顯著升高(n=7,P0.01),但升高幅度較1 mg/kg低,兩者無顯著差別;以上結(jié)果進(jìn)一步提示,THC對機(jī)體的作用可能根據(jù)給藥劑量的變化而呈現(xiàn)雙相性的表現(xiàn),即低劑量產(chǎn)生獎賞效應(yīng),而當(dāng)劑量升高到一定程度后產(chǎn)生厭惡效應(yīng),這種效應(yīng)是以NAc內(nèi)DA濃度變化為基礎(chǔ)的。又由于DA的變化在非敲除組與敲除組上呈現(xiàn)明顯不同,此結(jié)果呼應(yīng)了我們行為學(xué)研究的結(jié)論,更進(jìn)一步說明了THC作用的劑量依賴性和DA神經(jīng)元上CB1R對于厭惡作用的重要調(diào)節(jié)。在以上研究中,我們首次證明了VTA腦區(qū)DA能神經(jīng)元上存在CB1R,通過自身給光模型,發(fā)現(xiàn)小劑量THC發(fā)揮正性強(qiáng)化作用,劑量升高到一定程度則引起厭惡作用,為研究THC的中樞作用開辟了全新的研究領(lǐng)域。(三)谷氨酸神經(jīng)元參與四氫大麻酚作用及可能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究在VTA腦區(qū)除存在DA能神經(jīng)元外,還有Glu能神經(jīng)元。前期的研究發(fā)現(xiàn)CB1R在Glu能神經(jīng)元也有表達(dá),而該神經(jīng)元作為主要的興奮性神經(jīng)元,THC又會如何影響該類神經(jīng)元,發(fā)揮了怎樣的作用呢。本實(shí)驗(yàn)利用oICSS模型和Glu能神經(jīng)元上特異性敲除CB1R的小鼠Vglut2-CB1-/-來研究THC作用與Glu能神經(jīng)元之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)用如前所述光遺傳學(xué)技術(shù)和研究方法特異性興奮VTA的Glu能神經(jīng)元也可使小鼠產(chǎn)生oICSS行為,但是整體踏板次數(shù)低于DA興奮時的踏板次數(shù),且給予D1R與D2R阻斷劑后踏板次數(shù)均顯著降低(n=4,P0.01),提示激活Glu能神經(jīng)元后興奮了DA能神經(jīng)元產(chǎn)生獎賞效應(yīng);2)非敲除組(Vglut2-CB1+/+)與敲除組(Vglut2-CB1-/-)小鼠均腹腔分別給予可卡因(2 mg/kg、10 mg/kg)后,oICSS反應(yīng)曲線劑量依賴性地向左上方移動,在10 mg/kg劑量下曲線下面積均顯著增加(n=6,P0.01),曲線閾值與M50均顯著降低(n=6,P0.05),提示可卡因誘導(dǎo)DA增多后能夠增強(qiáng)獎賞效應(yīng);2)非敲除組與敲除組小鼠腹腔給予THC1 mg/kg后o ICSS曲線均出現(xiàn)左移趨勢,但無顯著性差異(n=6,P0.05);在腹腔給予THC 3 mg/kg后非敲除組小鼠oICSS曲線顯著右移,曲線下面積顯著減小(n=6,P0.01),曲線閾值與M50值顯著升高(n=6,P0.001);而敲除組小鼠則無上述變化(n=6,P0.05)。提示兩組小鼠對低劑量的THC反應(yīng)一致,但中劑量對非敲除組產(chǎn)生了抑制效應(yīng)。此抑制效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制可能與大劑量THC激活了Glu神經(jīng)元上的CB1R、下調(diào)Glu能神經(jīng)元功能、最終引起DA能神經(jīng)元功能下調(diào)相關(guān);3)腹腔給藥THC 1、3、10 mg/kg后,在3 mg/kg與10 mg/kg劑量下僅非敲除組小鼠自發(fā)活動顯著減少(n=8,P0.01),而對敲除組小鼠無影響(n=8,P0.05)。提示Glu神經(jīng)元上的CB1R參與調(diào)節(jié)了自發(fā)活動;4)腹腔給予THC 3mg/kg后,伴隨光刺激時,依舊可以升高已降低的自發(fā)活動(n=7,P0.05)提示該劑量的THC并沒有改變小鼠對于光刺激反應(yīng)性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Glu能經(jīng)元的興奮通過上調(diào)DA神經(jīng)元功能、增加DA的釋放介導(dǎo)獎賞效應(yīng)。外源性大麻(THC)通過激活Glu能神經(jīng)元上的CB1R、下調(diào)DA能神經(jīng)元功能,間接調(diào)節(jié)了中劑量THC產(chǎn)生的厭惡作用。綜上所述,本課題證明中腦邊緣皮質(zhì)DA系統(tǒng)在獎賞中發(fā)揮了重要作用;首次發(fā)現(xiàn)了由VTA發(fā)源的DA能神經(jīng)纖維投射在NAc core、NAc shell、IL和PL等腦區(qū)在獎賞行為正性強(qiáng)化作用中分別扮演的角色;成功建立了oICSS模型。首次發(fā)現(xiàn)DA能經(jīng)元上存在CB1R表達(dá)。在這一發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上,利用此模型研究發(fā)現(xiàn)外源性大麻通過激活位于DA能和Glu能神經(jīng)元上的CB1R,改變這些神經(jīng)元功能,實(shí)現(xiàn)其自身的低劑量獎賞效應(yīng)和中高劑量的厭惡效應(yīng)。本課題的研究為闡明DA系統(tǒng)在獎賞中的作用提供了理論依據(jù),為外源性大麻作用的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供了新線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R338

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本文編號：2139718