【摘要】：由于機(jī)體經(jīng)常暴露于來自內(nèi)源或外源的氧化物和親電物質(zhì)之下(如線粒體的有氧呼吸、紫外線、化學(xué)試劑等),導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)。一旦ROS在細(xì)胞內(nèi)積累過多,將導(dǎo)致氧化作用超出氧化物的清除,引起氧化還原反應(yīng)失衡,即氧化應(yīng)激。在細(xì)胞水平上,氧化應(yīng)激能引起細(xì)胞氧化損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。在生理水平上,氧化應(yīng)激可導(dǎo)致慢性、急性炎癥,并可能引起癌癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等疾病的發(fā)生。通常機(jī)體內(nèi)存在一套成熟的抗氧化防御機(jī)制來中和細(xì)胞產(chǎn)生的過量ROS,從而保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化損傷。在細(xì)胞抗氧化過程中,轉(zhuǎn)錄因子Nrf2作為最核心的調(diào)控分子參與到保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控過程中。其中Keap1-Nrf2-ARE信號通路被認(rèn)為是抗氧化機(jī)制中最重要的信號通路。細(xì)胞在正常生理水平下,Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1蛋白結(jié)合,后者介導(dǎo)Nrf2被泛素化降解,使Nrf2維持在一個較低的表達(dá)水平;當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時,氧化物與Keap1結(jié)合,阻礙了 Nrf2-Keap1復(fù)合物的形成,從復(fù)合物中脫離出的Nrf2可被PKC激酶磷酸化,促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核中,結(jié)合到其靶基因(Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因)啟動子的ARE序列元件上,激活靶基因的表達(dá),從而達(dá)到抗氧化的目的。近些年來,越來越多的實驗證據(jù)表明,Nrf2蛋白的活性受到多種翻譯后修飾的調(diào)控,如泛素化、磷酸化、乙�；蚐UMO化等。Nrf2蛋白的翻譯后修飾與Nrf2功能蛋白的活性、結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān),在該領(lǐng)域的研究有利于揭示Nrf2在細(xì)胞抗氧化過程新的作用機(jī)制。已有的研究發(fā)現(xiàn),Nrf2蛋白的多個賴氨酸位點能夠被p300/CBP乙�；�,增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性,并且有研究表明,在p300/CBP復(fù)合物中包含兩種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,PRMT1和CARM1,作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。但是目前并沒有關(guān)于Nrf2蛋白精氨酸甲基化修飾及其功能的報道。我們通過體外甲基化實驗,發(fā)現(xiàn)Nrf2蛋白在體外能夠被PRMT1甲基化,但是不能被CARM1甲基化。同時,內(nèi)源IP實驗和外源GST-pull down實驗證實,細(xì)胞中的Nrf2也能被PRMT1甲基化,并且兩者是相互結(jié)合的。我們對甲基化的Nrf2蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)Nrf2的第437位精氨酸被PRMT1甲基化;同時將Nrf2第437位精氨酸突變成賴氨酸后的體外甲基化實驗結(jié)果表明,Nrf2蛋白第437位精氨酸確實是唯一被PRMT1甲基化的位點。通過對Nrf2蛋白的結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),此位點位于Nrf2的DNA binding結(jié)構(gòu)域中。因此,我們推測,Nrf2蛋白第437位精氨酸甲基化修飾很可能與其DNA binding功能相關(guān)。正如我們預(yù)期的那樣,通過Realtime PCR分析,我們發(fā)現(xiàn)甲基化的Nrf2能夠促進(jìn)其靶基因HO-1、GCLM和TXNRD1的表達(dá);進(jìn)一步的ChIP以及EMSA等實驗表明,無論干涉PRMT1還是過表達(dá)第437位精氨酸突變成賴氨酸的Nrf2,都降低了Nrf2結(jié)合到其靶基因啟動子上的能力。為了進(jìn)一步探究甲基化的Nrf2的生理功能,我們利用氧化劑叔丁基過氧化氫處理細(xì)胞產(chǎn)生氧化壓力,建立了細(xì)胞的抗氧化模型。在此模型下,我們發(fā)現(xiàn),Nrf2的甲基化水平在細(xì)胞的抗氧化過程中呈上升趨勢,這表明Nrf2的甲基化在抗氧化過程中發(fā)揮重要作用。而進(jìn)一步通過細(xì)胞活力檢測實驗和細(xì)胞總谷胱甘肽水平檢測實驗,我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程中,甲基化的Nrf2能夠促進(jìn)細(xì)胞的抗氧化能力,從而提高細(xì)胞的存活力,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。綜上,我們的研究發(fā)現(xiàn)了 Nrf2蛋白新的翻譯后修飾類型,即精氨酸甲基化修飾。證實Nrf2蛋白第437位精氨酸被PRMT1甲基化修飾,這種修飾增強(qiáng)了 Nrf2蛋白在細(xì)胞抗氧化中的作用。并初步揭示了 Nrf2蛋白精氨酸甲基化修飾增強(qiáng)抗氧化作用的分子機(jī)制。該研究成果為開發(fā)靶向Nrf2翻譯后修飾的精準(zhǔn)醫(yī)療藥物,從而預(yù)防氧化損傷引起的疾病提供了重要的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , the expression of Nrf2 - Keap1 protein can be induced by oxidative stress , which can lead to cell death or apoptosis . In the process of cell oxidation , the expression of Nrf2 protein can be induced by various post - translational modifications , such as ubiquitination , phosphorylation , acetylation and SUMO . In this paper , we found that the methylation of Nrf2 plays an important role in the anti - oxidation of Nrf2 .
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R363

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本文編號：2134860