【摘要】：Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs),通過識別病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)啟動(dòng)一系列炎癥反應(yīng),以清除入侵的病原體。病原體攜帶的多種PAMPs往往同時(shí)活化多種TLRs,由于不同的TLRs介導(dǎo)的下游信號通路,彼此之間相互獨(dú)立,但又存在共同的匯聚點(diǎn),由此,多種TLRs介導(dǎo)的信號之間就會(huì)發(fā)交互串?dāng)_,表現(xiàn)出相互疊加、相互協(xié)同或相互拮抗等不同的免疫效應(yīng)。這對免疫調(diào)節(jié)具有特別的意義,然而,其背后的作用機(jī)制仍不完全清楚。一般情況下,TLRs所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能夠幫助機(jī)體清除病原體,維持免疫穩(wěn)態(tài)。但是,如果TLRs被過度激活,就會(huì)導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。前期研究中我們課題組發(fā)現(xiàn)的無免疫刺激性CpG-ODN c41分子,一段包含未甲基化Cp G結(jié)構(gòu)的20bp寡聚核苷酸(Cp G-ODN)序列(5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'),作為TLR9的拮抗劑,能夠保護(hù)小鼠免受刺激性Cp G-ODN的攻擊,表現(xiàn)出一定的抗炎作用。本研究利用TLR9拮抗劑Cp G-c41分子,在不激活TLR9信號通路的條件下,探究CpG-c41與其他TLRs間的交互作用,并利用Cp G-c41的無免疫刺激性,從一個(gè)全新的視角,探究其交互串?dāng)_機(jī)制,拓展我們對固有免疫中TLRs間免疫調(diào)節(jié)模式的理解。目的明確TLR9拮抗劑Cp G-c41分子對其他TLRs的交互影響,利用Cp G-c41的無免疫刺激性,明確交互影響發(fā)生的環(huán)節(jié)和作用機(jī)制。方法1.通過ELISA實(shí)驗(yàn)觀察CpG-c41對TLR1/2激動(dòng)劑Pam3CSK4、TLR2激動(dòng)劑HKLM、TLR3激動(dòng)劑poly(I:C)、TLR7/8激動(dòng)劑ss RNA120和TLR9激動(dòng)劑CpG-1826誘導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6釋放的影響,明確Cp G-c41分子與其他TLRs間的交互作用。2.通過激光共聚焦顯微鏡,觀察CpG-c41分子的吞噬入胞,掌握Cp G-c41的內(nèi)化過程;利用免疫熒光技術(shù)探究Cp G-c41入胞后的轉(zhuǎn)運(yùn)過程;采用Cp G-c41雙標(biāo)熒光探針(3'Cy3作為熒光報(bào)告基團(tuán)、5'BHQ-1作為熒光淬滅基團(tuán))研究CpG-c41在胞內(nèi)的代謝過程。3.利用免疫熒光技術(shù),觀察比較CpG-c41和其他TLR激動(dòng)劑內(nèi)化競爭和受體競爭情況,探究CpG-c41交互串?dāng)_的具體作用機(jī)制。4.通過ELISA實(shí)驗(yàn),探究CpG-c41是否影響激動(dòng)劑誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞釋放前炎癥細(xì)胞因子TNF-α,明確Cp G-c41對小鼠巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力的影響。結(jié)果1.Cp G-c41分子能夠有效抑制TLR3、TLR7/8和TLR9(內(nèi)膜型TLRs)誘導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的釋放,但不影響TLR1和TLR2(胞膜型TLRs)誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6的釋放。2.3'Cy3-c41(3'端標(biāo)記Cy3的Cp G-c41,紅色標(biāo)記)作用Raw264.7細(xì)胞5min后,胞內(nèi)開始出現(xiàn)紅色熒光,之后紅色熒光分子逐漸增多,約11h后胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值,隨后趨于穩(wěn)定,進(jìn)入平臺期,呈飽和狀態(tài)。3.胞內(nèi)的3'FAM-c41(3'端標(biāo)記FAM的Cp G-c41,綠色標(biāo)記)達(dá)飽和狀態(tài)后,再加入3'Cy3-c41,發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的綠色熒光逐漸減弱,紅色熒光逐漸增強(qiáng),即先前內(nèi)化的3'FAM-c41出胞,而環(huán)境中的3'Cy3-c41繼續(xù)入胞,說明Cp G-c41達(dá)平臺期后處于一種動(dòng)態(tài)平衡過程。4.不同熒光標(biāo)記的Cp G-c41作用細(xì)胞后,對于Cy3標(biāo)記,無論Cy3標(biāo)記在CpG-c41的3'端,還是5'端,均能觀察到胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光;對于FAM標(biāo)記,可以觀察到3'FAM-c41和5'3'FAM-c41(5',3'端同時(shí)標(biāo)記FAM的Cp G-c41)入胞后的熒光分布,但是,觀察不到5'FAM-c41的綠色熒光,而5'FAM-c41仍然能有效抑制CpG-1826釋放前炎癥因子TNF-α,說明5'FAM-c41依然入胞,只是通過磷酸二酯鍵連接的5'FAM發(fā)生了類似于核酸外切酶的作用,熒光基團(tuán)在入胞的過程中丟失了。5.Cp G-c41雙標(biāo)熒光探針(同時(shí)標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán))作用Raw264.7細(xì)胞40min后,胞內(nèi)開始出現(xiàn)紅色熒光分子,說明CpG-c41作用細(xì)胞40min后開始降解;Cp G-c41內(nèi)化7min后定位于網(wǎng)格蛋白,15min與早期內(nèi)體共定位,30min與溶酶體共定位,提示CpG-c41的內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)需要網(wǎng)格蛋白的參與,首先轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體,30min后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體,40min后開始降解。6.Cp G-1826和CpG-c41都與TLR9存在共定位現(xiàn)象。與3'Cy3標(biāo)記的CpG-1826組相比,CpG-c41加入后,Cp G-1826與TLR9無共定位現(xiàn)象。7.用FITC標(biāo)記的Poly(I:C)作用Raw264.7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)5min后胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光分子,之后逐漸增多;用FITC標(biāo)記的Poly(I:C)、3'Cy3-c41同時(shí)作用Raw264.7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)5min后胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光分子3'Cy3-c41,6h后才觀察到綠色熒光分子即FITC標(biāo)記的Poly(I:C)。與單獨(dú)的FITC標(biāo)記的Poly(I:C)相比,Cp G-c41的加入使Poly(I:C)的入胞時(shí)間延遲了。8.ssRNA120經(jīng)DOTAP包裹后,有效誘導(dǎo)HEK293/TLR7和HEK293/TLR8細(xì)胞釋放炎癥因子IL-8,CpG-c41的加入明顯抑制了IL-8的釋放;當(dāng)ssRNA120和CpG-c41同時(shí)用DOTAP包裹后,CpG-c41同樣能干擾ss RNA120對TLR7和TLR8的活化,說明干擾環(huán)節(jié)與胞膜資源爭奪無關(guān)。9.免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,3'Cy3-c41與TLR7、TLR8存在明顯的共定位現(xiàn)象。10.在只表達(dá)TLR3,TLR7,TLR8和TLR9,不表達(dá)CD14的HEK293細(xì)胞中,Cp G-c41的加入明顯抑制上述相應(yīng)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的NF-κB的活化。11.分別給予激動(dòng)劑Poly(I:C)/ssRNA120/Cp G-1826初次刺激,Raw264.7細(xì)胞再次接受Poly(I:C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后,TNF-α的釋放量較Medium組明顯減少,即TLR激動(dòng)劑的刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞免疫應(yīng)答能力衰減;然而,當(dāng)初次給予Medium或Cp G-c41處理,細(xì)胞再次接受Poly(I:C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后,與Medium組相比,Cp G-c41組正常釋放TNF-α,即CpG-c41與Medium一樣,不影響細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。結(jié)論1.Cp G-c41選擇性干擾內(nèi)膜型TLRs活化,對胞膜型TLRs沒有影響。Cp G-c41發(fā)揮的多重免疫抑制效應(yīng)與TLRs的分布有關(guān)。雖然胞膜型TLR1、TLR2與內(nèi)膜型TLR7/8和TLR9均依賴MyD88信號通路,但CpG-c41選擇性干擾內(nèi)膜型TLRs,而對胞膜型TLRs無影響。另一方面,盡管TLR3與TLR7/8、TLR9下游信號通路不同,但Cp G-c41均能抑制這幾種內(nèi)膜型TLR的活化。由此說明,Cp G-c41的交互干擾效應(yīng)與TLRs下游信號通路無關(guān),其串?dāng)_發(fā)生在信號級聯(lián)啟動(dòng)以前。2.Cp G-c41的內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)代謝過程。3'Cy3-c41作用Raw264.7細(xì)胞5min后開始入胞,約11h后進(jìn)入平臺期,呈飽和狀態(tài)。在Cp G-c41吞噬入胞的過程中,5'末端5'碳位點(diǎn)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Cp G-c41內(nèi)化15min后轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體,30min后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體,40min左右開始降解。由此,Cp G-c41的干預(yù)環(huán)節(jié)發(fā)生在Cp G-c41內(nèi)化入胞大致40min之前。Cp G-c41的內(nèi)化是一種動(dòng)態(tài)過程,即先前入胞的分子及降解產(chǎn)物不會(huì)在胞內(nèi)滯留,提示Cp G-c41的干擾效應(yīng)與內(nèi)體飽和無關(guān)。3.Cp G-c41對內(nèi)膜型TLRs的干擾機(jī)制針對不同的TLR,CpG-c41的干預(yù)方式也不相同,在入胞階段,CpG-c41通過與TLR3激動(dòng)劑Poly(I:C)競爭入胞干擾TLR3活化;在識別階段,Cp G-c41通過與TLR7/8或TLR9競爭性結(jié)合發(fā)揮干擾作用。以往普遍認(rèn)為TLR7/8特異性識別ss RNA,但本研究發(fā)現(xiàn)它們也能識別ssDNA,說明TLR7/8對配體識別的特異性是相對的,具有一定的兼容性。此外,CD14作為這四種內(nèi)膜型TLRs一種共同的輔助受體,極有可能參與了交互干擾過程。本研究明確地排除了CD14參與Cp G-c41的多重免疫抑制效應(yīng)。4.巨噬細(xì)胞接受刺激分子的作用后,免疫功能會(huì)耗竭,然而,對于非刺激性分子Cp G-c41,雖然經(jīng)過了內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)過程,但細(xì)胞的免疫功能并不受影響,提示Cp G-c41的無免疫刺激性和多重免疫抑制效應(yīng)為自身免疫疾病的防治提供了新的策略。
[Abstract]:Toll - like receptors ( TLRs ) are an important pattern recognition receptor ( PRRs ) in the innate immune system . By identifying pathogen - associated molecular patterns ( PAMPs ) , a series of inflammatory responses are initiated to clear invading pathogens . The interaction between CpG - c41 and other TLRs was investigated by ELISA . The fluorescence distribution of CpG - c41 ( Cp G - c41 ) was observed after 40 minutes . Compared with medium group , CpG - c41 inhibited the activation of IL - 8 and CpG - c41 . Cp G - c41 plays a key role in the activation of Cp G - c41 . In the recognition phase , CpG - c41 plays a key role in the activation of Cp G - c41 . In this study , the effect of Cp G - c41 on ligand recognition is not the same . In recognition stage , the immune function of Cp G - c41 is not affected by the binding of the TLR7 / 8 or TLR9 .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392
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本文編號：
2119248
