本文選題：金黃色葡萄球菌 + SasA　； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：金黃色葡萄球菌(以下簡(jiǎn)稱金葡菌)是一種重要的條件致病菌,能夠?qū)е露喾N疾病,包括皮膚和軟組織的輕微感染、肺炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎、中毒性休克綜合征和骨髓炎等。多重耐藥金葡菌株(如甲氧西林耐藥金葡菌,methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的出現(xiàn)和流行,使得依賴抗生素的治療手段不再可靠,進(jìn)行金葡菌疫苗和抗體的研究迫在眉睫。金葡菌的多種致病因子已被作為潛在的免疫靶點(diǎn)進(jìn)行研究,然而目前還沒(méi)有一個(gè)金葡菌的疫苗和抗體顯示對(duì)人體有效,提示我們有必要開展針對(duì)金葡菌其他抗原的研究。金葡菌Sas A(S.aureus surface protein A)蛋白是金葡菌的一個(gè)表面蛋白,屬于SRRP(serine-rich repeat proteins)蛋白家族,之前的研究表明Sas A蛋白的主要功能是粘附素。在小鼠金葡菌感染模型中,我們發(fā)現(xiàn)Sas A蛋白的主動(dòng)免疫和Sas A單抗的被動(dòng)免疫具有保護(hù)性,結(jié)合分子流行病學(xué)的調(diào)查和生物信息學(xué)的分析,我們認(rèn)為Sas A是抵御金葡菌感染的一個(gè)新的候選免疫靶點(diǎn)。生物信息學(xué)和分子流行病學(xué)的調(diào)查表明Sas A基因在臨床菌株中分布廣泛,Sas A蛋白含有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。我們對(duì)36個(gè)全基因組測(cè)序公開的金葡菌株進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析,這些菌株來(lái)源廣泛,具有一定的代表性,經(jīng)檢驗(yàn)所有的菌株都攜帶Sas A基因。另外,我們從306醫(yī)院分離得到了42株臨床金葡菌,對(duì)這些菌株進(jìn)行基因分型后證實(shí)85%的ST239(中國(guó)MRSA流行株)都攜帶Sas A基因。Sas A蛋白是一個(gè)具有2,271個(gè)氨基酸的表面蛋白,結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析(Motif Scan)顯示Sas A蛋白包含兩個(gè)絲氨酸富集重復(fù)的結(jié)構(gòu)域(serine-rich repeatregions,SRR)和一個(gè)非重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(non-repeat region,NRR),SRR1、NRR和SRR2的氨基酸序列分別為48-229aa、230-751aa和752-2213aa。序列同源分析表明SRR1、NRR和SRR2在不同菌株間的同源性分別為75.8%、90.4%和49.3%,NRR是Sas A最為保守的結(jié)構(gòu)域。此外,我們采集了金葡菌感染病人的血清和健康人的血清,ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)檢測(cè)顯示金葡菌感染病人血清中Sas A的抗體水平顯著高于健康人,表明在感染人體時(shí)金葡菌會(huì)表達(dá)Sas A,并且能夠刺激人體產(chǎn)生針對(duì)Sas A的抗體反應(yīng)。Sas A蛋白的主動(dòng)免疫具有保護(hù)性。我們制備了Sas A蛋白的不同重組表達(dá)片段:SRR1(48-229aa)、NRR(230-751aa)、NRR1(230-540aa)和NRR2(490-751aa)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示SRR1、NRR和NRR1具有良好的免疫原性,能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗體反應(yīng)。在小鼠金葡菌腹腔感染模型中,SRR1和NRR1的主動(dòng)免疫能夠保護(hù)小鼠對(duì)于金葡菌USA300(北美流行株)的致死攻毒,而NRR和NRR2片段不具有免疫保護(hù)性。另外,我們制備了針對(duì)SRR1-NRR1(48-540aa)的鼠多抗,被動(dòng)免疫后同樣在小鼠金葡菌感染模型中具有保護(hù)性,提示我們體液免疫在Sas A蛋白免疫保護(hù)性中起到了重要作用�？筍as A單抗的被動(dòng)免疫具有保護(hù)性。除了疫苗的主動(dòng)免疫,抗體的被動(dòng)免疫也是抵御金葡菌感染的重要手段。單抗具有高同質(zhì)性、高穩(wěn)定性和低免疫原性的特點(diǎn),通過(guò)雜交瘤技術(shù)和ELISA篩選,我們制備了針對(duì)Sas A不同表位并具有高效價(jià)的Sas A單抗。對(duì)這些單抗進(jìn)行體外活性和體內(nèi)保護(hù)性評(píng)價(jià)后,我們對(duì)單抗2H7進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。2H7單抗識(shí)別Sas A的保守結(jié)構(gòu)域并能結(jié)合金葡菌,具有增強(qiáng)中性粒細(xì)胞調(diào)理吞噬殺傷的活性。通過(guò)5’RACE、反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR我們擴(kuò)增得到了2H7的抗體輕重鏈基因,進(jìn)而分析了抗體可變區(qū)的序列。ELISA實(shí)驗(yàn)顯示單抗2H7不能結(jié)合SRR1,而對(duì)NRR1和NRR具有高親和力,表明2H7識(shí)別的是Sas A的保守結(jié)構(gòu)域,并且2H7能夠直接識(shí)別金葡菌。之前的研究表明Sas A具有結(jié)合人血小板的功能,在金葡菌心內(nèi)膜炎感染中起到重要作用。我們首先通過(guò)流式實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Sas A的NRR結(jié)構(gòu)域而不是SRR1區(qū)能夠結(jié)合小鼠的血小板。然而,單抗2H7并不能抑制Sas A與血小板的結(jié)合,提示我們2H7在心內(nèi)膜炎感染模型中可能并不具有保護(hù)性。中性粒細(xì)胞是宿主對(duì)抗病原體感染的重要防線,抗體作為調(diào)理素能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬殺傷。在體外鼠全血?dú)Ｐ秃腿酥行粤＜?xì)胞HL-60細(xì)胞系模型中,2H7都體現(xiàn)出了調(diào)理吞噬殺傷金葡菌的活性。2H7單抗在小鼠金葡菌感染模型中具有保護(hù)性。鑒于長(zhǎng)期進(jìn)行血液透析和腹膜透析的病人容易遭受MRSA的感染,我們?cè)谛∈蠼鹌暇Y模型和腹腔感染模型中評(píng)價(jià)了2H7的保護(hù)性,并且選擇USA300和ST239作為攻毒菌株,二者分別是北美地區(qū)和亞洲地區(qū)的MRSA流行株。在菌血癥模型中,攻毒前24 h被動(dòng)免疫2H7單抗,能夠保護(hù)小鼠對(duì)于USA300和ST239的致死攻毒。并且2H7也顯示出治療性應(yīng)用的潛力,致死攻毒1 h后被動(dòng)免疫2H7也能夠提高小鼠的生存率。在腹腔感染模型中,2H7同樣能夠保護(hù)小鼠對(duì)于USA300和ST239的致死攻毒。考慮到臨床上的金葡菌感染病人并不會(huì)接觸高劑量的金葡菌,我們?cè)诰Y模型和腹腔感染模型中也進(jìn)行了亞致死攻毒的保護(hù)性實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示2H7能夠減少腎臟的金葡菌菌落數(shù),并且能夠減少金葡菌腹腔膿腫的形成。綜上所述,Sas A基因在金葡菌中分布廣泛,Sas A蛋白含有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,并且Sas A蛋白的主動(dòng)免疫和Sas A單抗的被動(dòng)免疫在小鼠金葡菌感染模型中具有保護(hù)性。以上結(jié)果證實(shí)Sas A蛋白是抵御耐藥金葡菌感染的一個(gè)新的候選免疫靶點(diǎn)。
[Abstract]:Staphylococcus aureus ( S . aureus surface protein A ) is a new candidate immune target for Staphylococcus aureus . In vivo experiments show that SRR1 , NRR and NRR1 have a protective effect on Sas A . In addition , we have prepared different recombinant expression fragments of Sas A . In addition , we have prepared different recombinant expression fragments of Sas A . In addition , we have prepared different recombinant expression fragments of Sas A . The results showed that 2H7 could protect mice from lethal challenge of USA300 and ST239 . The results showed that 2H7 could reduce the number of Staphylococcus aureus colonies in the kidney , and could decrease the survival rate of mice . In conclusion , the Sas A protein contained a conserved domain , and Sas A protein had a protective effect in the model of Staphylococcus aureus infection .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.11

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本文編號(hào)：2096496