本文選題：脂聯(lián)素 + 線粒體自噬　； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景與目的脂聯(lián)素,也被稱為apM1,Acrp30,GBP28和adipoQ,主要由脂肪組織產(chǎn)生的循環(huán)激素。許多藥理研究表明,該蛋白具有抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化和抗炎作用。雖然已經(jīng)有一些研究證明這種蛋白質(zhì)有抗氧化活性,但是在骨骼肌中具體的調(diào)節(jié)機制還不是很清楚。本研究的目的是探討脂聯(lián)素對小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12氧化損傷的保護作用及分子機制。方法本研究通過過氧化氫(H2O2)氧化應(yīng)激的經(jīng)典模型來模擬氧化損傷。脂聯(lián)素預(yù)處理骨骼肌細(xì)胞C2C12之后,用過氧化氫處理來模擬氧化損傷。通過檢測細(xì)胞活力來確定過氧化氫處理的濃度和時間以及脂聯(lián)素的適宜濃度。通過檢測活性氧來分析脂聯(lián)素對細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響。通過Annexin V/PI雙染色法檢測脂聯(lián)素對細(xì)胞凋亡的影響。蛋白印記檢測脂聯(lián)素對抗氧化物質(zhì)的影響。通過檢測線粒體膜電位的變化,證明脂聯(lián)素對線粒體的保護作用。通過線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔抑制劑米酵菌酸(BA)來探討脂聯(lián)素對線粒體膜電位改變的調(diào)控機制。利用共聚焦顯微鏡檢測脂聯(lián)素對氧化損傷引起的自噬流的影響,線粒體自噬的影響,線粒體和溶酶體的共定位情況的影響。通過加入自噬抑制劑氯喹(CQ)進一步驗證脂聯(lián)素對線粒體自噬改變的影響。通過線粒體DNA拷貝數(shù)檢測脂聯(lián)素對脂聯(lián)素對線粒體DNA的影響。通過蛋白印跡和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)探討脂聯(lián)素對線粒體自噬和凋亡影響的分子機制。結(jié)果通過細(xì)胞活力檢測發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素濃度為1~30μg/mL時對骨骼肌細(xì)胞沒有任何毒性,濃度為30μg/m L時對細(xì)胞活力有顯著升高作用。過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷對細(xì)胞活力的抑制作用具有時間和劑量依賴性,脂聯(lián)素預(yù)處理能夠顯著提高過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞活力抑制作用。過氧化氫處理之后,提高骨骼肌細(xì)胞活性氧(ROS)水平,脂聯(lián)素預(yù)處理之后能夠顯著抑制活性氧的水平,與此同時,脂聯(lián)素預(yù)處理之后顯著抑制了過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。脂聯(lián)素能夠增強抗氧化物質(zhì)Nrf2和HO-1的表達。過氧化氫處理之后顯著降低線粒體膜電位,脂聯(lián)素預(yù)處理顯著抑制線粒體膜電位的下降。線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔抑制劑米酵菌酸預(yù)處理能夠提高過氧化氫引起的細(xì)胞活力下降。過氧化氫處理之后,自噬小體和自噬溶酶體都增多,脂聯(lián)素預(yù)處理之后顯著降低自噬小體和自噬溶酶體的數(shù)量,抑制過氧化氫誘導(dǎo)的線粒體自噬,同時也抑制溶酶體和線粒體的共定位。過氧化氫處理之后,線粒體自噬指示劑線粒體內(nèi)膜蛋白TIM23逐漸降低,LC3-II逐漸增加,脂聯(lián)素預(yù)處理之后TIM23降解減少,而對LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換沒有影響。脂聯(lián)素預(yù)處理能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的Pink1和Parkin的增加。加入自噬抑制劑氯喹之后,能夠顯著逆轉(zhuǎn)過氧化氫誘導(dǎo)的TIM23降解,而對脂聯(lián)素預(yù)處理的TIM23水平無明顯影響。脂聯(lián)素抑制過氧化氫誘導(dǎo)的線粒體DNA的降解。脂聯(lián)素抑制過氧化氫處理之后,凋亡相關(guān)Bax/Bcl-2比率升高,脂聯(lián)素抑制Bax的轉(zhuǎn)錄水平,明顯降低Bax/Bcl-2的比率,抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)論這些結(jié)果表明,脂聯(lián)素對小鼠骨骼肌細(xì)胞氧化損傷具有細(xì)胞保護作用,脂聯(lián)素緩解過氧化氫誘導(dǎo)的生長抑制,增加細(xì)胞抗氧化能力,清除過氧化氫誘導(dǎo)的活性氧的能力。脂聯(lián)素抑制過氧化氫誘導(dǎo)的自噬流增加,抑制Pink1、Parkin的增加,抑制線粒體自噬,部分抑制溶酶體和線粒體的共定位。此外,脂聯(lián)素抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,抑制Bax的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平及凋亡相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果表明,脂聯(lián)素在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體自噬過程中具有一定的調(diào)節(jié)作用,抑制細(xì)胞凋亡。由于其抗氧化損傷的作用,可以考慮將其作為一個骨骼肌氧化損傷有關(guān)疾病的防治藥物。
[Abstract]:Background and objective adiponectin, also known as apM1, Acrp30, GBP28, and adipoQ, mainly produced by the adipose tissue. Many pharmacological studies have shown that the protein has anti diabetic, anti atherosclerotic and anti-inflammatory effects. Although some studies have shown that the protein has antioxidant activity, it is specific in skeletal muscle. The purpose of this study is to explore the protective effect and molecular mechanism of adiponectin on C2C12 oxidative damage in skeletal muscle cells in mice. Methods this study simulated oxidative damage through the classical model of oxidative stress of hydrogen peroxide (H2O2). After adiponectin pretreated skeletal muscle cells C2C12, hydrogen peroxide treatment was used to simulate the oxidative damage. Oxidative damage. The concentration and time of hydrogen peroxide treatment and the appropriate concentration of adiponectin were determined by detecting cell viability. The effects of adiponectin on the level of oxidative stress were analyzed by detecting reactive oxygen species. The effect of adiponectin on apoptosis was detected by Annexin V/PI double staining. Protein imprint detection of adiponectin against oxidation The effects of substance. By detecting the changes in mitochondrial membrane potential, the protective effect of adiponectin on mitochondria was demonstrated. The regulation mechanism of adiponectin to mitochondrial membrane potential change was explored by BA. The effect of adiponectin on autophagic flow induced by oxidative damage was detected by confocal microscopy. The effects of mitochondrial autophagy, the co localization of mitochondria and lysosomes. The effect of adiponectin on mitochondrial autophagy by adding autophagic inhibitor chloroquine (CQ). The effects of adiponectin on the mitochondrial DNA were detected by the mitochondrial DNA copy number. The molecular mechanism of the effect of adiponectin on autophagy and apoptosis should be explored. Results by cell viability detection, it is found that the concentration of adiponectin is 1~30 mu g/mL without any toxicity to the skeletal muscle cells, and the cell viability is significantly elevated when the concentration is 30 u g/m L. The inhibition effect of oxidative damage induced by hydrogen peroxide on cell viability In time and dose dependence, adiponectin preconditioning could significantly increase the inhibitory effect of hydrogen peroxide induced cell activity. After hydrogen peroxide treatment, the activity oxygen (ROS) level of skeletal muscle cells was enhanced. Adiponectin pretreatment could significantly inhibit the level of reactive oxygen species, and the preconditioning of adiponectin inhibited hydrogen peroxide significantly after adiponectin pretreatment. Induced apoptosis. Adiponectin can enhance the expression of antioxidant Nrf2 and HO-1. After hydrogen peroxide treatment, the mitochondrial membrane potential is significantly reduced. Adiponectin preconditioning significantly inhibits the decrease of mitochondrial membrane potential. Mitochondrial permeability translocation inhibitor michcolic acid preconditioning can increase the activity of hydrogen peroxide induced cell viability. After hydrogen peroxide treatment, autophagosome and autophagosome are increased. Adiponectin pretreatment significantly reduces the number of autophagosomes and autophagosomes, inhibits the mitochondrial autophagy induced by hydrogen peroxide, and inhibits the co localization of lysosomes and mitochondria. After hydrogen peroxide treatment, mitochondrial autophagy indicator mitochondria are in the mitochondria. The membrane protein TIM23 gradually decreased, LC3-II increased gradually, and the degradation of TIM23 decreased after adiponectin pretreatment, but had no effect on LC3-I conversion to LC3-II. The adiponectin pretreatment could inhibit the increase of Pink1 and Parkin induced by hydrogen peroxide. After adding the autophagic inhibitor chloroquine, the degradation of TIM23 induced by hydrogen peroxide could be markedly reversed, and the lipoprotein association was found. Adiponectin inhibited the degradation of mitochondrial DNA induced by H2O2. Adiponectin inhibited the degradation of mitochondrial DNA induced by hydrogen peroxide. After the inhibition of hydrogen peroxide treatment, adiponectin inhibited the apoptosis related Bax/Bcl-2 ratio, inhibited the transcriptional level of Bax, significantly reduced the ratio of Bax/Bcl-2 and inhibited the transcription of apoptosis related proteins. The results show that adiponectin has a protective effect on the oxidative damage of skeletal muscle cells in mice. Adiponectin relieves the growth inhibition induced by hydrogen peroxide, increases the antioxidant capacity of the cells, and clears the ability of hydrogen peroxide induced reactive oxygen species. Adiponectin inhibits the increase of the autophagic flow induced by hydrogen peroxide, inhibits the increase of Pink1, Parkin, and inhibits the grain size. Autophagy partially inhibits the co localization of lysosomes and mitochondria. In addition, adiponectin inhibits the apoptosis induced by hydrogen peroxide and inhibits the transcriptional level and protein level of Bax and the transcriptional level of apoptosis related proteins. These results suggest that adiponectin has a certain regulatory role in the process of autophagy induced by oxidative stress. Apoptosis can be considered as a preventive and therapeutic agent for oxidative damage related to skeletal muscle because of its antioxidant effects.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R363

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本文編號：2062754