發(fā)布時(shí)間：2018-06-24 18:44

  本文選題：戊型肝炎病毒 + 疫苗　； 參考：《東南大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒,主要經(jīng)消化道傳播引起急性戊型肝炎(hepatitis E, HE)。HE病死率高,在孕婦中可高達(dá)20%,慢性肝病患者合并HEV感染易引發(fā)肝功能衰竭。此外,近年發(fā)現(xiàn)在器官移植和免疫缺陷患者中HE可以慢性化并導(dǎo)致肝纖維化。HE在發(fā)展中國(guó)家多見,但由于HEV的動(dòng)物源性特點(diǎn),近年在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病數(shù)也大幅增加。我國(guó)自2012年起連續(xù)3年戊型肝炎發(fā)病人數(shù)超過(guò)甲型肝炎發(fā)病人數(shù),成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此,加強(qiáng)戊型肝炎疫苗的研發(fā)并及時(shí)推廣應(yīng)用對(duì)預(yù)防和控制戊型肝炎意義重大。根據(jù)HEV全基因序列的差異,世界各地的HEV毒株主要分為4個(gè)基因型。其中基因1、2型只感染人,與HE流行和爆發(fā)相關(guān),基因3、4型既可感染人又可感染動(dòng)物,提示HEV不同基因型毒株以及不同宿主來(lái)源的毒株具有不同的生物學(xué)特性,據(jù)此有人將HEV分成H型(Human)和Z型(Zonosis)。由于HEV難以培養(yǎng),不能得到大量的病毒進(jìn)行抗原結(jié)構(gòu)的分析,因此只能用基因工程表達(dá)的HEV結(jié)構(gòu)蛋白來(lái)代替。HEV的結(jié)構(gòu)蛋白由其ORF2基因編碼,聚合為病毒衣殼。多項(xiàng)研究表明,HEV ORF2基因編碼蛋白C端2/3部分含有HEV優(yōu)勢(shì)抗原表位,包括能誘導(dǎo)免疫保護(hù)力的中和抗原表位,是HE疫苗研發(fā)的主要靶點(diǎn)。目前我國(guó)已有兩種HE疫苗處于臨床試驗(yàn)階段或已上市,一種是由廈門大學(xué)利用大腸桿菌以包涵體形式表達(dá)的HEV 1型ORF2片斷編碼的重組蛋白p239 (aa368-606)已成功上市,成為全球首支上市的HE疫苗。另一種由我們實(shí)驗(yàn)室和長(zhǎng)春生物制品研究所聯(lián)合研發(fā)的利用大腸桿菌可溶性表達(dá)的HEV重組蛋白p179(aa452-630),能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的特異性HEV中和抗體,最近已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)HEVORF2基因編碼蛋白C端452-617aa的重組蛋白(p166)含有HEV構(gòu)型依賴性中和抗原表位,可定位于460-605aa,因此p166可作為包被抗原,應(yīng)用間接法ELISA對(duì)HEV感染后血清、HEV疫苗p239和p179免疫后血清中的抗-HEV進(jìn)行檢測(cè)分析。當(dāng)用不同基因型和亞型的p166抗原對(duì)HE病人和HEV實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物血清進(jìn)行抗體ELISA滴定時(shí)發(fā)現(xiàn)其敏感性不同,提示HEV感染后其血清中抗-HEV的產(chǎn)生具有一定的基因型特異性。但是不同基因來(lái)源的HEV疫苗免疫后血清中抗-HEV是否有差異,即不同基因型HEV疫苗是否存在免疫原性的差異至今一直未見報(bào)道。HE疫苗的免疫原性主要體現(xiàn)為疫苗免疫機(jī)體后血清中抗-HEV IgG的滴度高低。由于p239和p179兩種HE疫苗來(lái)自HEV不同基因型,尤其是它們的片段大小各不一樣,因此本論文通過(guò)間接法ELISA,分別應(yīng)用等長(zhǎng)片段的4種基因型p166作為包被抗原檢測(cè)p239和p179疫苗免疫后小鼠、人血清以及基因1型和4型HEV毒株攻擊后恒河猴血清中抗-HEVIgG,通過(guò)分析不同基因型p166抗原與血清樣本中抗HEV IgG免疫反應(yīng)的差異,對(duì)不同基因型HE疫苗p239和p179的免疫原性差異進(jìn)行比較。另外,p166重組蛋白內(nèi)還含有同時(shí)包含在p239和p179疫苗內(nèi)的中和抗原表位,分別以基因1型和4型p166為免疫原制備鼠源單克隆抗體(McAbs),應(yīng)用間接法ELISA、Western blot、體外中和試驗(yàn)以及建立競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA鑒定所制備的McAbs的基因型特異性,來(lái)分析p239和p179免疫原性的基因型差異機(jī)制。旨在為安全高效HE疫苗的研制、HEV血清型分析、診斷試劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。一、不同基因型戊型肝炎疫苗p239和p179的免疫原性差異首先以p239和p179疫苗各免疫6只Balb/c小鼠,每只10ug,定期采集小鼠血清,用4種基因型混合抗原p166mix (p166w01、p166Mex、p166US、p166Chn等量混合)作為包被抗原,檢測(cè)抗-HEV IgG抗體,監(jiān)測(cè)抗體的變化；繼后再分別用4種基因型p166為包被抗原檢測(cè)免疫后第20周小鼠血清中抗-HEV IgG;其次采集p239和p179疫苗3針免疫7個(gè)月后人血清,分別用4種基因型p166為包被抗原檢測(cè)其與各血清樣本中抗HEV-IgGo為了進(jìn)一步分析天然HEV病毒顆粒是否同樣存在免疫原性的基因型差異,分別用105病毒滴度的HEV 1型W01毒株和4型NJ703毒株靜脈攻擊恒河猴,定期采集猴血清,p166mix作為包被抗原檢測(cè)恒河猴血清中抗-HEV IgG抗體,監(jiān)測(cè)抗體的變化,再分別用4種基因型p166作為包被抗原,用間接ELISA檢測(cè)攻毒后第12周恒河猴血清中抗-HEV IgG,研究血清中抗HEV IgG的基因型差異,以上所有檢測(cè)血清樣本均從1：2000開始倍比稀釋至1：64000。通過(guò)分析血清中抗HEV IgG的基因型差異,比較不同基因型HE疫苗的免疫原性差異。結(jié)果如下：A. p166W01、p166Mex抗原與p239免疫后的小鼠血清中抗-HEV IgG的免疫反應(yīng)明顯高于p166US或p166Chn,但是p239免疫后小鼠血清抗HEV-IgG在抗原p166W01和p166Mex之間無(wú)顯著性差異,在抗原p166US和p166Chn之間也無(wú)顯著性差異；p166US、p166Chn與p179免疫后的小鼠血清抗HEV-IgG免疫反應(yīng)明顯高于p166W01或p166Mex,而免疫反應(yīng)性在抗原p166US和p166Chn之間、p166W01和p166Mex之間同樣未見明顯差異。其中83%的p239免疫小鼠血清抗HEV-IgG免疫反應(yīng)結(jié)果在抗原p166W01與p166Chn相比,其抗體滴度存在2倍或2倍以上差異,83%的p179免疫小鼠血清抗-HEV IgG在抗原p166W01和p166Chn之間的免疫反應(yīng)顯示抗體滴度存在2倍或2倍以上差異,其中4倍或以上滴度差異的均為33.3%。B.分別用等量4種基因型p166作為包被抗原檢測(cè)p179疫苗和p239疫苗Ⅰ期臨床試驗(yàn)3針免疫后7個(gè)月血清中抗-HEV IgG,并比較4種基因型p166在與不同疫苗免疫后血清ELISA反應(yīng)的差異,p166W01和p166Mex與p239疫苗免疫血清抗-HEV IgG ELISA反應(yīng)明顯高于p166US或p166Chn,顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而p166W01和p166Mex對(duì)血清中的抗-HEV IgG的檢出未見顯著性差異,抗原p166US和p166Chn對(duì)血清的抗-HEV IgG的檢出結(jié)果無(wú)顯著性差異；與此相反,p179疫苗免疫血清與抗原p166US和p166Chn的反應(yīng)結(jié)果明顯高于抗原p166W01或p166Mex。54%的p239疫苗和63%的p179免疫后血清在與基因1型p166抗原和基因4型p166抗原之間免疫反應(yīng)的抗體滴度達(dá)到2倍或2倍以上滴度差異,其中4倍或以上滴度差異分別為：p239疫苗免疫后血清為20%,p179疫苗免疫后血清為26%。C.分別用等量的4種不同基因型p166檢測(cè)W01和NJ703攻毒后8周恒河猴血清中的抗-HEV IgG抗體,W01、NJ703攻毒后恒河猴血清中抗HEV IgG與不同基因型p166免疫反應(yīng)結(jié)果顯示出明顯的基因型差異,即W01攻擊恒河猴血清與p166W01和p166Mex的免疫反應(yīng)明顯高于p166US或p166Chn,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,NJ703攻擊恒河猴血清與p166US、p166Chn的免疫反應(yīng)明顯高于p166W01或p166Mex。8份恒河猴HEV攻毒后血清在與基因1型p166抗原免疫反應(yīng)性與4型p166抗原之間均存在4倍或4倍以上的滴度差異。以上結(jié)果表明,基因1型]HE Vp239疫苗和基因4型HEV p179疫苗免疫小鼠和人血清、基因1型HEV毒株W01和基因4型HEV毒株NJ703攻擊恒河猴后在血清中產(chǎn)生的抗-HEV IgG均具有明顯的基因型差異,反映出p239疫苗和p179疫苗以及天然HEV病毒顆粒均存在免疫原性的基因型差異,即基因1型HE p239疫苗和基因1型HEV病毒顆粒免疫血清中會(huì)產(chǎn)生基因1、2型特異性IgGs;而基因4型HE p179疫苗和基因4型HEV病毒顆粒免疫血清中會(huì)產(chǎn)生基因3、4型特異性IgGs。這些結(jié)果與HEV的H型和Z型分型相吻合。二、戊型肝炎疫苗基因型差異的機(jī)制探討以上國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)的不同基因型HE疫苗p239和p179以及不同基因型HEV毒株W01和NJ703免疫原性的差異,推測(cè)其機(jī)制應(yīng)該是抗原表位的差異,我們推測(cè)它們之間除了存在HEV共同抗原表位外還具有HEV基因型(1、2基因型和3、4基因型)的特異性抗原表位。免疫學(xué)中研究抗原表位最有效的工具和手段是McAbs。為此我們選擇均包含在p239疫苗和p179疫苗內(nèi)的并含有中和性抗原表位的p166為免疫原制備鼠源性McAbs。結(jié)果如下：A.以HEV第1基因型p166Sar(巴基斯坦株)為免疫原制備鼠源McAbs,采用間接ELISA法及免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)McAbs與4種基因型HEV ORF2重組蛋白p166W01、p166Mex、p166US和p166Chn的交叉反應(yīng)性。用獲得的McAbs細(xì)胞制備腹水,利用基于PCR的HEV體外中和試驗(yàn),檢測(cè)它們對(duì)基因1、2、3、4型人HEV的中和活性。結(jié)果如下：獲得3株穩(wěn)定分泌抗-p166 McAbs的雜交瘤細(xì)胞株,即3G1、4H4、2B1。其中3G1、4H4分泌的McAb與已知基因1、2、3、4型p166均結(jié)合；而2B1分泌的McAb只與1、2型p166特異結(jié)合,而不與已知基因3、4型p166結(jié)合。尤為重要的是,體外中和試驗(yàn)結(jié)果顯示3G1分泌的McAb腹水可以同時(shí)中和4種基因型HEV,而2B1的McAb腹水只能中和1、2型HEV,不能中和3、4型HEV。B.以HEV第4基因型p166Chn(中國(guó)株)為免疫原制備鼠源單克隆抗體(McAbs),采用間接ELISA法及免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)McAbs與已知基因型HEV ORF2重組蛋白p166W01、p166Mex、p166US和p166Chn的交叉反應(yīng)性。用獲得的McAbs細(xì)胞制備腹水,利用基于PCR的HEV體外中和試驗(yàn),檢測(cè)它們對(duì)基因1-4型HEV的中和活性。結(jié)果如下：獲得3株穩(wěn)定分泌抗-p166 McAbs的雜交瘤細(xì)胞株,即5G5、6A1、4C5。其中5G5、6A1分泌的McAb與已知基因1、2、3、4型p166均結(jié)合；而4C5分泌的McAb只與3、4型p166特異結(jié)合,而不與已知基因1、2型p166結(jié)合。尤為重要的是,5G5分泌的McAb腹水同時(shí)能中和1、2、3、4型HEV,而4C5的McAbs腹水只能中和3、4型HEV,不能中和1、2型HEV。C.分別將針對(duì)p166Sar的鼠源性中和性McAbs 2B1、3G1, p166Chn免疫小鼠獲得的中和性McAbs 4C5、5G5,進(jìn)行純化以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP),分別用基因1型p166W01和基因4型p166Chn作為包被抗原,并通過(guò)方陣滴定確定包被抗原和酶標(biāo)單抗的最佳稀釋度,建立競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA,通過(guò)檢測(cè)不同單抗之間是否能夠競(jìng)爭(zhēng)與同一抗原結(jié)合,判斷其是否作用于同一抗原表位,進(jìn)一步判斷疫苗上抗原表位的異同。結(jié)果：McAb 3G1與McAb 5G5均不能抑制HRP-2B1與包被抗原p166W01的結(jié)合,說(shuō)明McAb 3G1和McAb2B1在第1基因型重組蛋白p166W01上所對(duì)應(yīng)的抗原表位不同。而McAb 3G1與McAb5G5可相互競(jìng)爭(zhēng)與包被抗原p166W01結(jié)合,說(shuō)明來(lái)源于基因1型p166的McAb 3G1與來(lái)源于基因4型p166的McAb 5G5作用于同一抗原表位,即第1基因型重組蛋白p166存在共同型中和抗原表位以及第1、2型特異性中和性的抗原表位。而McAb 3G1、5G5與4C5之間的競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)果顯示：McAb 3G1與McAb 5G5不能抑制]3RP-4C5與包被抗原p166Chn的結(jié)合,同樣說(shuō)明p166Chn存在4種基因型共同型中和抗原表位以及第3、4基因型特異性中和性抗原表位。以上結(jié)果提示HEV ORF2重組蛋白p166既含有不同基因型HEV共同的中和抗原表位,也含有基因1、2型特異性、基因3、4型特異性的中和抗原表位,具有不同的抗原特征。由于HE疫苗p239和p179均含有p166抗原片段,p166抗原表位的基因型差異完全可以解釋p239和p179疫苗免疫原性的基因型差異,甚至也可以解釋不同基因型HEV毒株感染猴血清與不同基因型p166抗原反應(yīng)性的差異。HEV基因型特異性中和抗原表位不僅僅存在于基因工程表達(dá)的抗原蛋白上,而且也存在于天然的HEV病毒顆粒上。本研究就HE疫苗p239和p179的免疫原性差異及其機(jī)制開展了系統(tǒng)的研究,揭示了上述新的現(xiàn)象和內(nèi)在關(guān)系,相信這些新的發(fā)現(xiàn)必將豐富HEV的研究成果,會(huì)對(duì)HEV的生物學(xué)特性、HE疫苗的研制、疫苗p239和p179的應(yīng)用、HEV血清學(xué)分型、診斷試劑的開發(fā)提供有益的幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2062553