本文選題：霍亂弧菌 + 活的非可培養(yǎng)狀態(tài)��； 參考：《中國疾病預(yù)防控制中心》2016年博士論文

【摘要】：為了在不利的環(huán)境中保持存活的能力,霍亂弧菌會進(jìn)入一種活的非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。VBNC這一現(xiàn)象已經(jīng)被認(rèn)識30年了,但對研究者來說依然是待解開的謎團(tuán)。為了更好的認(rèn)識這一現(xiàn)象,我們以霍亂弧菌為模式菌,設(shè)計并實施了以下三個方面的研究來解釋這一現(xiàn)象。在第一個部分的研究中,我們利用propidium monoazide(PMA)結(jié)合熒光定量PCR對VBNC狀態(tài)的霍亂弧菌01群埃爾托性菌株C6706進(jìn)行定量分析。首先對108/mL的鮮活細(xì)胞、死亡細(xì)胞和VBNC細(xì)胞對不同的PMA處理程序進(jìn)行時間-劑量-反應(yīng)關(guān)系分析。結(jié)果顯示最優(yōu)的PMA處理方案為20μM孵育20分鐘,因為這可以最大限度的去除死亡細(xì)胞,但對鮮活細(xì)胞和VBNC細(xì)胞幾乎沒有影響。然后,我們評價了該方案在處理不同濃度細(xì)菌時的穩(wěn)定性和檢出下限,發(fā)現(xiàn)初始細(xì)菌的濃度對PMA處理的效果有很大影響。我們開發(fā)了一種利用108/mL的外源死細(xì)胞懸液來對抗初始細(xì)胞濃度副作用的方法。利用這個方案,消除了初始細(xì)胞濃度過低的影響,得到了穩(wěn)定的計數(shù)結(jié)果,并將該方法對VBNC細(xì)胞計數(shù)的檢出下限提升至10拷貝/μL。在第二部分的研究中,我們逐一評價了實驗室常規(guī)使用的VBNC誘導(dǎo)條件的5個組成因素對VBNC誘導(dǎo)的影響,即菌株差異、生長期差異、通氧差異、不同的溫度以及饑餓。其中菌株差異、生長期差異和通氧差異不影響VBNC狀態(tài)的形成,但是影響其發(fā)展過程�；魜y弧菌O1群古典型的菌株比埃爾托型菌株進(jìn)入VBNC的速度要快。以平臺期細(xì)胞為初始細(xì)胞完全進(jìn)入VBNC的時間(LCT100)要晚于對數(shù)期細(xì)胞。但是在誘導(dǎo)前期,對數(shù)期細(xì)胞可培養(yǎng)菌數(shù)下降的速度卻比平臺期要慢,這提示平臺期細(xì)胞狀態(tài)的不均一性可能在起作用。在誘導(dǎo)過程中,通氧可以快速使霍亂弧菌喪失可培養(yǎng)的能力,厭氧環(huán)境下的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)可達(dá)到通氧條件的106倍。其余的兩個因素(較高的溫度和富營養(yǎng))卻可以阻止霍亂弧菌VBNC狀態(tài)的發(fā)生。在22℃和37℃誘導(dǎo)時,霍亂弧菌快速喪失可培養(yǎng)能力,在可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)分別達(dá)到106/mL和105/mL時維持恒定�；罹鷶�(shù)和總菌數(shù)的結(jié)果表明在這兩個溫度下,喪失可培養(yǎng)能力的霍亂弧菌沒有進(jìn)入VBNC狀態(tài),而是不斷死亡和降解。當(dāng)在ASW中加入LB時,VBNC的誘導(dǎo)也被阻止,但加入低營養(yǎng)的M9不影響。這表明LB和M9不同的成分可能會抑制VBNC的誘導(dǎo)。在第三部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)可以對抗霍亂弧菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)。利用轉(zhuǎn)座子突變技術(shù),我們篩選到了一株在4℃ASW中可培養(yǎng)能力被延長的突變株,并發(fā)現(xiàn)該菌株的轉(zhuǎn)座子插入位點為rpoN基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)受rpoN基因調(diào)節(jié)的hapR基因被失活后,菌株進(jìn)入VBNC狀態(tài)的進(jìn)程明顯加快。而高表達(dá)HapR可以延緩霍亂弧菌可培養(yǎng)能力的喪失。缺失qrrs,lux0和rpoN均可使可培養(yǎng)細(xì)菌存在的時間相比hapR缺失株延長50天以上。然后我們發(fā)現(xiàn)野生株也利用上調(diào)表達(dá)hapR來對抗其在VBNC誘導(dǎo)過程中可培養(yǎng)能力的喪失。在野生株誘導(dǎo)過程中hapR的轉(zhuǎn)錄上調(diào),使其可培養(yǎng)細(xì)菌存在的時間比hapR缺失株延長10天。當(dāng)hapR缺失株回補hapR基因后,其hapR的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平,以及可培養(yǎng)能力的變化群恢復(fù)到野生株水平。在天然QS突變株中,高表達(dá)HapR表現(xiàn)為對VBNC誘導(dǎo)過程中可培養(yǎng)能力喪失的抵抗;低表達(dá)或無表達(dá)HapR則表現(xiàn)為可培養(yǎng)能力喪失的加速。這些菌株的存在表明了生態(tài)環(huán)境的壓力對霍亂弧菌QS進(jìn)化的影響。這些研究將有助于將來對VBNC狀態(tài)如何發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。同時也幫助深入認(rèn)識在VBNC誘導(dǎo)過程中霍亂弧菌進(jìn)行了哪些生命活動,以及環(huán)境壓力對不同VBNC發(fā)展能力的菌群的篩選。
[Abstract]:In the study of the first part , we evaluated the stability and the lower limit of VBNC . In the study of the second part , we evaluated the stability and the lower limit of the initial cell concentration .
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.3

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