本文選題：DNA免疫 + 單克隆抗體　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分艱難梭菌外毒素A單克隆抗體的研制及抗體特性研究目的:利用DNA免疫平臺,研制針對艱難梭菌外毒素A(Clostridium difficile toxin A,Tcd A)抗原的高親和力的單克隆抗體(monoclonal antibody,m Ab,縮寫成單抗),并研究其特異性和抗毒素活性等相關(guān)特性,為艱難梭菌Tcd A實驗室診斷和免疫治療提供依據(jù)。方法:以表達Tcd A羧基端受體結(jié)合區(qū)(Tcd A-C)的DNA疫苗為免疫原,利用DNA初免結(jié)合蛋白加強免疫的免疫策略,將免疫后的BALB/c小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合產(chǎn)生雜交瘤。通過Tcd A抗原捕獲ELISA篩選產(chǎn)生抗原特異的雜交瘤細胞,用有限稀釋法篩選單克隆抗體的雜交瘤細胞。用ELISA分析,確定單克隆抗體識別的抗原表位。通過細胞功能試驗和小鼠毒素攻擊保護試驗,研究Tcd A-C特異的單克隆抗體保護作用。結(jié)果:經(jīng)過5輪篩選和分析,本課題最終獲得6株Tcd A特異的具有高度親和力和高度特異性的雜交瘤細胞株,這些細胞株能穩(wěn)定分泌針對Tcd A-C的單克隆抗體。研究表明,除了1株單抗(1G3F10)為Ig G1外,其余5株單抗均為Ig G2a。CHO細胞和小鼠毒素攻擊保護試驗表明,3株單抗(2C7B6,5D8D5和4A4F2)具有部分保護功能,保護細胞和小鼠免受Tcd A毒素攻擊作用。m Ab 1G3F10和5D8D5識別共同的抗原決定簇,m Ab 2D4D3、4A4F2、2C7B6和1B5F5識別另一個抗原決定簇。最終5D8D5包被和HRP-2C7B6檢測成功配對形成診斷試劑盒,可以檢測臨床分離株中毒素的分泌量。結(jié)論:通過DNA免疫成功制備Tcd A特異的單抗,具有一定的保護作用。利用2株高親和力的單克隆抗體,研制出艱難梭菌外毒素A的診斷試劑盒。第二部分艱難梭菌外毒素B單克隆抗體的研制及抗體特性研究目的:利用DNA免疫平臺,研制針對艱難梭菌外毒素B(Clostridium difficile toxin B,Tcd B)抗原的高親和力的單克隆抗體,并研究其特異性和抗毒素活性等相關(guān)特性,為艱難梭菌Tcd B實驗室診斷和免疫治療提供依據(jù)。方法:以表達Tcd B氨基端(Tcd B-N)或羧基端(Tcd B-C)的DNA疫苗為免疫原,利用DNA初免結(jié)合蛋白加強免疫的免疫策略,將免疫后的BALB/c小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合產(chǎn)生雜交瘤。通過Tcd B抗原捕獲ELISA篩選產(chǎn)生抗原特異的雜交瘤細胞,用有限稀釋法篩選單克隆抗體的雜交瘤細胞。用ELISA分析,確定單克隆抗體識別的抗原表位。結(jié)果:經(jīng)過篩選和分析,最終獲得12株具有高度親和力和高度特異性的雜交瘤細胞株,其中9株細胞株能穩(wěn)定分泌針對Tcd B-C的單克隆抗體,其中3株細胞株能穩(wěn)定分泌針對Tcd B-N的單克隆抗體。特性分析表明,其中單抗7G1F2、4A9E3和1D5B3為Ig G2a,4B4B1為Ig G2b,其余8株單抗為Ig G1。最終7E2G3包被和HRP-4A9E3檢測成功配對形成診斷試劑盒,可以檢測臨床分離株中Tcd B毒素的分泌量。結(jié)論:通過DNA免疫免疫成功制備Tcd B-N和Tcd B-C特異的單抗。利用2株高親和力的單克隆抗體,研制出艱難梭菌外毒素B診斷試劑盒。第三部分DNA免疫制備的針對多種抗原的單克隆抗體Ig基因克隆及抗體序列分析目的:利用DNA免疫平臺,制備針對多種感染性病原的單克隆抗體,并鑒定其相關(guān)特性�？寺〔⒎治鲞@些單克隆抗體的全長基因序列,分析DNA免疫對小鼠B細胞發(fā)育成熟的影響。方法:以表達流感H5-VN HA、H7-ZJU01 HA或HIV Gag-C8的DNA疫苗分別為免疫原,利用DNA初免結(jié)合蛋白加強免疫或者細胞加強免疫的免疫策略,免疫后的BALB/c小鼠脾細胞經(jīng)過與小鼠SP2/0骨髓瘤細胞融合,通過ELISA對雜交瘤細胞進行篩選和鑒定。獲得的雜交瘤細胞株利用RNA連接酶介導(dǎo)的c DNA末端快速擴增(RNA ligase mediated rapid-amplification of c DNA ends,RLM-RACE)技術(shù)擴增Ig的全長基因序列。結(jié)果:在獲得的眾多單抗中,選擇具有代表性13株雜交瘤細胞株,通過RLM-RACE技術(shù)最終得到各自的重鏈和輕鏈的全長基因序列。分析這些序列以及CDR3的序列的變化,可以看出輕鏈的CDR3區(qū)長度固定,變異度小,而重鏈CDR3區(qū)的長度長并且變異度大。結(jié)論:利用DNA免疫成功制備針對多種感染性疾病病原的小鼠的單克隆抗體并通過RACE獲得單克隆抗體的基因序列,該技術(shù)平臺是分析小鼠B細胞發(fā)育成熟的非常有用的工具。
[Abstract]:A monoclonal antibody against Clostridium difficile toxin A ( Tcd A - C ) was prepared by ELISA . 浠ヨ〃杈綯cd B姘ㄥ熀绔，

本文編號：2015207