本文選題：DNA免疫 + 單克隆抗體��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分艱難梭菌外毒素A單克隆抗體的研制及抗體特性研究目的:利用DNA免疫平臺(tái),研制針對(duì)艱難梭菌外毒素A(Clostridium difficile toxin A,Tcd A)抗原的高親和力的單克隆抗體(monoclonal antibody,m Ab,縮寫(xiě)成單抗),并研究其特異性和抗毒素活性等相關(guān)特性,為艱難梭菌Tcd A實(shí)驗(yàn)室診斷和免疫治療提供依據(jù)。方法:以表達(dá)Tcd A羧基端受體結(jié)合區(qū)(Tcd A-C)的DNA疫苗為免疫原,利用DNA初免結(jié)合蛋白加強(qiáng)免疫的免疫策略,將免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤。通過(guò)Tcd A抗原捕獲ELISA篩選產(chǎn)生抗原特異的雜交瘤細(xì)胞,用有限稀釋法篩選單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。用ELISA分析,確定單克隆抗體識(shí)別的抗原表位。通過(guò)細(xì)胞功能試驗(yàn)和小鼠毒素攻擊保護(hù)試驗(yàn),研究Tcd A-C特異的單克隆抗體保護(hù)作用。結(jié)果:經(jīng)過(guò)5輪篩選和分析,本課題最終獲得6株Tcd A特異的具有高度親和力和高度特異性的雜交瘤細(xì)胞株,這些細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌針對(duì)Tcd A-C的單克隆抗體。研究表明,除了1株單抗(1G3F10)為Ig G1外,其余5株單抗均為Ig G2a。CHO細(xì)胞和小鼠毒素攻擊保護(hù)試驗(yàn)表明,3株單抗(2C7B6,5D8D5和4A4F2)具有部分保護(hù)功能,保護(hù)細(xì)胞和小鼠免受Tcd A毒素攻擊作用。m Ab 1G3F10和5D8D5識(shí)別共同的抗原決定簇,m Ab 2D4D3、4A4F2、2C7B6和1B5F5識(shí)別另一個(gè)抗原決定簇。最終5D8D5包被和HRP-2C7B6檢測(cè)成功配對(duì)形成診斷試劑盒,可以檢測(cè)臨床分離株中毒素的分泌量。結(jié)論:通過(guò)DNA免疫成功制備Tcd A特異的單抗,具有一定的保護(hù)作用。利用2株高親和力的單克隆抗體,研制出艱難梭菌外毒素A的診斷試劑盒。第二部分艱難梭菌外毒素B單克隆抗體的研制及抗體特性研究目的:利用DNA免疫平臺(tái),研制針對(duì)艱難梭菌外毒素B(Clostridium difficile toxin B,Tcd B)抗原的高親和力的單克隆抗體,并研究其特異性和抗毒素活性等相關(guān)特性,為艱難梭菌Tcd B實(shí)驗(yàn)室診斷和免疫治療提供依據(jù)。方法:以表達(dá)Tcd B氨基端(Tcd B-N)或羧基端(Tcd B-C)的DNA疫苗為免疫原,利用DNA初免結(jié)合蛋白加強(qiáng)免疫的免疫策略,將免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤。通過(guò)Tcd B抗原捕獲ELISA篩選產(chǎn)生抗原特異的雜交瘤細(xì)胞,用有限稀釋法篩選單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。用ELISA分析,確定單克隆抗體識(shí)別的抗原表位。結(jié)果:經(jīng)過(guò)篩選和分析,最終獲得12株具有高度親和力和高度特異性的雜交瘤細(xì)胞株,其中9株細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌針對(duì)Tcd B-C的單克隆抗體,其中3株細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌針對(duì)Tcd B-N的單克隆抗體。特性分析表明,其中單抗7G1F2、4A9E3和1D5B3為Ig G2a,4B4B1為Ig G2b,其余8株單抗為Ig G1。最終7E2G3包被和HRP-4A9E3檢測(cè)成功配對(duì)形成診斷試劑盒,可以檢測(cè)臨床分離株中Tcd B毒素的分泌量。結(jié)論:通過(guò)DNA免疫免疫成功制備Tcd B-N和Tcd B-C特異的單抗。利用2株高親和力的單克隆抗體,研制出艱難梭菌外毒素B診斷試劑盒。第三部分DNA免疫制備的針對(duì)多種抗原的單克隆抗體Ig基因克隆及抗體序列分析目的:利用DNA免疫平臺(tái),制備針對(duì)多種感染性病原的單克隆抗體,并鑒定其相關(guān)特性�？寺〔⒎治鲞@些單克隆抗體的全長(zhǎng)基因序列,分析DNA免疫對(duì)小鼠B細(xì)胞發(fā)育成熟的影響。方法:以表達(dá)流感H5-VN HA、H7-ZJU01 HA或HIV Gag-C8的DNA疫苗分別為免疫原,利用DNA初免結(jié)合蛋白加強(qiáng)免疫或者細(xì)胞加強(qiáng)免疫的免疫策略,免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞經(jīng)過(guò)與小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,通過(guò)ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。獲得的雜交瘤細(xì)胞株利用RNA連接酶介導(dǎo)的c DNA末端快速擴(kuò)增(RNA ligase mediated rapid-amplification of c DNA ends,RLM-RACE)技術(shù)擴(kuò)增Ig的全長(zhǎng)基因序列。結(jié)果:在獲得的眾多單抗中,選擇具有代表性13株雜交瘤細(xì)胞株,通過(guò)RLM-RACE技術(shù)最終得到各自的重鏈和輕鏈的全長(zhǎng)基因序列。分析這些序列以及CDR3的序列的變化,可以看出輕鏈的CDR3區(qū)長(zhǎng)度固定,變異度小,而重鏈CDR3區(qū)的長(zhǎng)度長(zhǎng)并且變異度大。結(jié)論:利用DNA免疫成功制備針對(duì)多種感染性疾病病原的小鼠的單克隆抗體并通過(guò)RACE獲得單克隆抗體的基因序列,該技術(shù)平臺(tái)是分析小鼠B細(xì)胞發(fā)育成熟的非常有用的工具。
[Abstract]:A monoclonal antibody against Clostridium difficile toxin A ( Tcd A - C ) was prepared by ELISA . 浠ヨ〃杈綯cd B姘ㄥ熀绔，

本文編號(hào)：2015207