本文選題：MEP途徑 + BaDRL　； 參考：《西北大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景及意義:隨著抗生素耐藥性問題不斷加劇,對(duì)多種疾病可選用的治療辦法正在耗盡,臨床上迫切需要新型抗生素的研究與開發(fā)。類異戊二烯化合物合成過程中的關(guān)鍵酶2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)合成酶,又稱1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)化酶(DXR)是最有前景的抗生素篩選靶標(biāo)之一。以DXR為靶點(diǎn)篩選的抗生素膦胺霉素具有用于治療由多重耐藥菌和惡性瘧原蟲(Plasmodium)引起的感染的潛力。最新的研究發(fā)現(xiàn)一些主要致病菌如巴爾通體屬(Bartonella)和布魯桿菌屬(Brucella)的菌體內(nèi)不存在DXR蛋白,而是被一種DRL酶(DXR-like,或稱Ⅱ型DXR)所替代。雖然DRL與DXR的功能相同,但是兩者無論是在系統(tǒng)發(fā)生樹還是在晶體結(jié)構(gòu)上都具有明顯的差異。因此有可能針對(duì)BaDRL篩選一批抗菌譜窄、特異性強(qiáng)的抗菌化合物。研究?jī)?nèi)容:本文首先成功構(gòu)建了E.coli BL21(DE3)-BaDRL工程菌株,對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)布魯桿菌源BaDRL。使用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)時(shí),BaDRL表現(xiàn)出菌體產(chǎn)量低,酶活性不高等問題;通過進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件,使用自誘導(dǎo)方式培養(yǎng)不僅解決了菌體產(chǎn)量低的情況而且獲得的酶活力大大增強(qiáng)。其次,以葡萄糖為原料模擬體內(nèi)糖酵解途徑,采用“一鍋法”酶法合成了純度較高的DRL底物DXP,用于研究BaDRL催化機(jī)制。最后,利用羰基化合物中的羰基與溶劑H2O交換氧原子這一現(xiàn)象,在H218O中進(jìn)行DRL催化DXP向MEP轉(zhuǎn)化的反應(yīng),通過分析產(chǎn)物MEP的18O標(biāo)記位置和相對(duì)豐度,推測(cè)酶BaDRL催化DXP轉(zhuǎn)化過程中與底物DXP可能的結(jié)合方式。結(jié)果:通過優(yōu)化改進(jìn)目的蛋白BaDRL誘導(dǎo)條件,得到了產(chǎn)量高(約10g菌體沉淀/500mL LB培養(yǎng)基)、純度好、活性良好的BaDRL。BaDRL最適pH范圍是7-9,溫度是40℃,同時(shí)我們還測(cè)定了 BaDRL的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。18O標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明標(biāo)記產(chǎn)物為[2-18O]MEP,推測(cè)DRL酶與底物DXP可能是通過DXP的C3-C4位方式結(jié)合的。
[Abstract]:Background and significance: with the increasing problem of antibiotic resistance, the available treatments for many diseases are being exhausted, and the research and development of new antibiotics are urgently needed in clinic. One of the most promising antibiotic screening targets is the key enzyme of isoprene synthesis, 2-methyl-Dalgin 4-phosphate (MEP) synthase, also known as 1-deoxy-Dxylglycine-5-phosphoric acid reductive isomerization enzyme (DXR). The DXR targeted antibiotic phosphamicin has the potential to treat infections caused by multidrug resistant bacteria and Plasmodium falciparum. Recent studies have found that DXR proteins are not present in some of the major pathogenic bacteria such as Bartonella and Brucella. but are replaced by a DRL enzyme called DXR-like, or type 鈪，

本文編號(hào)：2012747