本文選題：嗜肺軍團(tuán)菌 + 重組鞭毛蛋白�。� 參考：《寧夏醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:探討嗜肺軍團(tuán)菌重組鞭毛蛋白(recombinant flagellin A,rflaA)、重組巨噬細(xì)胞增強(qiáng)蛋白(recombinant macrophage inflammatory protein,rmip)對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞功能影響及其NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體1(Nucleotide-binding Oligomerization Domain1,NOD1)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain1,NOD2)是否參與分泌細(xì)胞因子功能初步研究。方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:采用(0.00、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000)μg/m L rflaA、(0、0.067、0.136、0.271、0.542、1.084、2.168、4.335)μg/mL rmip處理RAW 264.7細(xì)胞,并設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組,采用CCK-8法確定rflaA、rmip半數(shù)效應(yīng)劑量(median effective concentration,EC50)。按照EC50測(cè)定劑量分別稀釋1/5、1/10、1/20進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組,(0.04μg/mL rflaA低劑量組、0.08μg/m L rfla A中劑量組、0.16μg/mL rflaA高劑量組)rflaA及(0.02μg/mL rmip低劑量組、0.04μg/mL rmip中劑量組、0.08μg/mL rmip高劑量組)rmip處理RAW 264.7細(xì)胞,并設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。2.細(xì)胞活性測(cè)定:將倍比稀釋的rflaA、rmip分別作用RAW 264.7細(xì)胞24、48、72h,用cck8法檢測(cè)細(xì)胞活性。3.用不同劑量rflaA、rmip處理RAW 264.7細(xì)胞作用24h,檢測(cè)趨化功能;收集細(xì)胞上清液,ELISA檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞分泌趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor,MIF)的分泌水平。4.用不同劑量rflaA、rmip處理RAW 264.7細(xì)胞作用6、12、24、36、48 h,收集細(xì)胞,采用qrt-pcr法檢測(cè)mcp-1、mif的mrna含量。5.用不同劑量rflaa、rmip處理raw264.7細(xì)胞作用24、48、72h檢測(cè)細(xì)胞吞噬功能。6.分別收集24、36、48h細(xì)胞上清液,采用elisa檢測(cè)raw264.7細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,il-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1beta,il-1β)、白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α,il-1α)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,il-10)。7.用不同劑量rflaa、rmip處理raw264.7細(xì)胞作用6、12、24、36、48h,收集細(xì)胞,采用qrt-pcr法檢測(cè)il-6、il-1β、il-1α、il-10、干擾素-r(lnterferongamma,ifn-r)、腫瘤壞死因子a(tumornecrosisfactor,tnf-a)、nlrp3、nod1、nod2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(thereceptor-interactingserin-threonineproteinkinase2,rip2)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1(cysteinylaspartate-specific-1,casp-1)mrna含量。采用westernblot法檢測(cè)nod1、nod2、rip2、nlrp3、casp-1蛋白表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用graphpadprism5.0軟件計(jì)算rflaa、rmip重組蛋白的ec50;計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用x±s表示,多組不同時(shí)間數(shù)據(jù)比較方差分析,采用spss19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.細(xì)胞活性檢測(cè):結(jié)果顯示,raw264.7細(xì)胞的活性隨著rflaa、rmip劑量的增加而活性降低。有顯著差異性(p0.01),隨著rflaa、rmip劑量的增加,raw264.7細(xì)胞的活性降低,有顯著差異性(p0.01),24h優(yōu)于其它時(shí)間段,不同時(shí)間存在交互效應(yīng)(p0.05)最大值在孵育24h,最小值在孵育72h。用graphpadprism5.0軟件計(jì)算rflaa蛋白的ec50,rflaec50劑量0.8μg/ml,rmipec50劑量0.43ug/ml。2.rflaa、rmip促進(jìn)raw264.7細(xì)胞的mcp-1、mif分泌。不同劑量rflaa、rmip作用raw264.7細(xì)胞24h后,mcp-1、mif分泌能力隨重組蛋白劑量增加而增加,尤以高劑量時(shí)增加明顯,與對(duì)照組及其它分組均有差異性(p0.05)。3.rflaa、rmip促進(jìn)raw264.7細(xì)胞mcp-1、mifmrna水平表達(dá),不同劑量rflaa、rmip作用RAW 264.7細(xì)胞6、12、24、36、48h后,隨劑量增加促進(jìn)MCP-1、MIF分泌,以高劑量時(shí)分泌水平增加明顯,12h時(shí)分泌水平達(dá)到峰值。隨著作用時(shí)長(zhǎng)增加有下降趨勢(shì),與對(duì)照組及其它分組均有差異性(P0.05)。4.rflaA、rmip作用RAW 264.7細(xì)胞,其吞噬功能減弱,不同劑量rfla A、rmip作用RAW 264.7細(xì)胞24h、48、72h后,隨重組蛋白增加吞噬功能下降,與對(duì)照組均有差異性(P0.05)。5.不同劑量的rflaA、rmip作用RAW 264.7細(xì)胞24、36、48h后,隨著重組蛋白劑量的增加分泌增加,RAW 264.7分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-10增加,以高劑量增加明顯,36h分泌達(dá)峰值,隨著作用時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)有下降趨勢(shì),與對(duì)照組均有差異性(P0.05)。6.不同劑量的rflaA、rmip作用RAW264.7細(xì)胞6、12、24、36、48h后,隨著重組蛋白劑量的增加分泌增加,RAW 264.7細(xì)胞IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-10、IFN-γ、TNF-α、NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、CASP-1mRNA表達(dá)水平增加,以高劑量表達(dá)水平增加明顯,12h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到峰值,隨著作用時(shí)長(zhǎng)增加有下降趨勢(shì),與對(duì)照組及其它分組均有差異性(P0.05)。7.不同劑量的rflaA、rmip作用RAW 264.7細(xì)胞6、12、24、36、48 h后,隨劑量增加NOD1、NOD2、RIP2、NLRP3、CASP-1表達(dá)水平,以高劑量蛋白表達(dá)量增加明顯,24h達(dá)峰值,隨著作用時(shí)長(zhǎng)表達(dá)量有下降趨勢(shì),與對(duì)照組及其它分組有差異性(P0.05)。結(jié)論:1.rflaA、rmip增加巨噬細(xì)胞趨化功能及細(xì)胞因子分泌,下調(diào)其吞噬能力。2.rflaA可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞因子分泌,可能與NLRP3、CASP-1調(diào)控有關(guān)。3.rmip可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞因子分泌�？赡芘cNOD1、NOD2、RIP2調(diào)控有關(guān)。
[Abstract]:Objective : To investigate whether recombinant flagellin A ( rflaA ) , recombinant macrophage inflammatory protein ( rmip ) and recombinant macrophage inflammatory protein ( rmip ) were involved in the function of RAW264.7 cells in mice and whether they were involved in the function of cytokine secretion . Methods : 1 . Experimental group : ( 0.00 , 0.125 , 0.250 , 0.500 , 1.000 , 2.000 , 4.000 , 8.000 ) 渭g / ml rmip was used to treat RAW 264.7 cells , and a cell control group was established . The median effective concentration ( EC50 ) of rflaA and rmip was determined by CCK - 8 method . The cells were collected 24 , 12 , 24 , 36 , 48 h with different doses of rflaa and rmip . The levels of IL - 6 , IL - 1尾 , IL - 1偽 , IL - 10 , IFN - 緯 , TNF - 偽 , NOD1 , NOD2 , RIP2 , NLRP3 and CASP - 1 mRNA in RAW 264.7 cells increased with increasing dose .
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2008252