本文選題：抗生素耐受結核分枝桿菌 + Rv1473　； 參考：《西南大學》2017年碩士論文

【摘要】：細菌對抗生素的耐受已經成為全球面臨的大問題,特別是多重耐藥菌的出現,給臨床上抗菌治療帶來極大的困難,一些原本具有良好效果的藥物也失去了療效,對耐藥菌感染的治療迫在眉睫。細菌對抗生素的耐藥有多種途徑,藥物靶基因的突變和藥物外排泵的活動是其中兩個重要途徑。藥物外排泵可以把抗生素主動排出,降低胞內抗生素含量,實現藥物耐受。外排泵的作用除了直接降低胞內抗生素濃度外,還會提高細菌耐藥突變率,造成高水平、多種抗生素交叉耐藥。因此,對藥物外排泵的深入研究,對于臨床上抗菌治療具有重要意義。結核病是由結核分枝桿菌引起的,僅次于艾滋病的第二大傳染病,極大地威脅全球人類的健康。臨床上結核分枝桿菌的耐藥同樣嚴重,特別是近年來出現的多耐藥、廣泛耐藥甚至是全耐藥結核分枝桿菌的出現,再加上和HIV的共感染,結核病的治療形勢非常嚴峻,結核分枝桿菌耐藥機理的研究對于結核病的控制和治療十分重要。藥物外排泵的活動也是結核分枝桿菌耐藥的重要途徑,根據分子結構及轉運底物的不同,結核分枝桿菌外排泵可以分為5個亞家族,即ATP結合盒超家族(ABC)、主要易化超家族(MFS)、耐受小節(jié)分裂區(qū)家族(RND)、小耐多藥性家族(SMR)及多藥及毒性外排家族(MATE),其中ABC型外排泵需要ATP水解驅動,其他四種需要依靠質子動力勢驅動。在結核分枝桿菌中有一些外排泵被發(fā)現參與抗結核藥物的外排,包括異煙肼、利福平、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等。本課題以結核分枝桿菌Rv1473為研究對象,Rv1473屬于ABC亞家族,含有NBD結構域,可以結合和水解ATP,生物信息學預測其可能是大環(huán)內酯類外排泵。為了研究Rv1473蛋白的功能,我們首先在大腸桿菌中構建了Rv1473基因的過表達菌株,表達并純化了Rv1473重組蛋白,通過ATPase檢測試劑盒發(fā)現Rv1473重組蛋白可以和ATP結合,具有較高的ATPase活性,表明Rv1473可能水解ATP為物質跨膜轉運提供能量。生長快、無毒的恥垢分枝桿菌是研究致病性分枝桿菌的理想模型,恥垢分枝桿菌MSMEG_3140和Rv1473是同源基因,其編碼蛋白的氨基酸序列同源性在80%以上。我們通過同源重組的方法構建了恥垢分枝桿菌MEMEG_3140基因的敲除菌株(△MSMEG_3140),并構建了回補菌株(△MSMEG_3140::Rv1473)。我們發(fā)現相比較野生型,△MSMEG_3140缺失菌株對大環(huán)內酯類更敏感,而且缺失菌株在相同時間內積累的EB更多,回補菌株可以恢復到野生表型,這表明Rv1473可能和大環(huán)內酯類外排有關系。我們用RT-PCR檢測了恥垢分枝桿菌MSMEG_3140在大環(huán)內酯類處理下轉錄水平,發(fā)現MEMEG_3140在大環(huán)內酯類處理下表達上調。根據轉錄組數據顯示Rv1473在大環(huán)內酯類家族成員羅紅霉素處理下表達上調,為了驗證這個結果,我們測定了Rv1473的啟動子在大環(huán)內酯類處理下的活性,發(fā)現其啟動子活性增強,以上結果可以充分說明Rv1473是一個大環(huán)內酯類外排泵。另外,有文章報道外排泵蛋白可能參與生物膜的形成,我們測定了野生型、缺失型和回補型菌株的生物膜形成能力,并沒有顯著性差異,說明Rv1473可能不參與恥垢分枝桿菌生物膜的形成。Rv1473和ctpD、trxA、trxB、echA12和Rv1473A共轉錄,我們推測Rv1473可能和ctpD合作共同完成大環(huán)內酯類的跨膜轉運。Rv1473可能參與到whiB7介導的結核分枝桿菌對大環(huán)內酯類的天然抗性調節(jié)過程中。本論文首次揭示了Rv1473是一個新的大環(huán)內酯類外排泵,所得的初步研究結果將為深入開展以外排泵為靶點相關抑制劑的開發(fā)提供參考。
[Abstract]:The tolerance of bacteria to antibiotics has become a major problem facing the world, especially the emergence of multidrug-resistant bacteria, which brings great difficulties to the clinical antibiotic treatment. Some drugs that have good effects have also lost the curative effect. The treatment of antibiotic resistant bacteria is imminent. The mutation and the activity of the drug efflux pump are two important ways. The drug efflux pump can discharge antibiotics voluntarily, reduce the intracellular antibiotic content and achieve drug tolerance. The efflux pump can increase the rate of bacterial resistance in addition to the intracellular antibiotic concentration directly, and cause a high level of antibiotic cross resistance. Therefore, the in-depth study of the drug efflux pump is of great significance for the clinical antibacterial treatment. Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis, which is second only to the second major infectious diseases of AIDS, which greatly threatens the health of the world. Drug-resistant and even all drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, combined with the co infection of HIV, is very severe in the treatment of tuberculosis. The study of the mechanism of Mycobacterium tuberculosis is important for the control and treatment of tuberculosis. The activity of the drug efflux pump is also an important way for the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis, according to the molecular structure and transport. Different substrates, Mycobacterium tuberculosis efflux pump can be divided into 5 subfamilies, the ATP binding cassette superfamily (ABC), the main superfamily (MFS), the small division family (RND), the small resistant multidrug-resistant family (SMR) and the multidrug and toxic efflux family (MATE), in which the ABC type pump needs ATP hydrolysis drive and the other four need to rely on proton movement. Force potential drive. In Mycobacterium tuberculosis, some of the outer row pumps are found to participate in anti tuberculosis drugs, including isoniazid, rifampicin, aminoglycosides, fluoroquinolones, etc. this topic is based on Mycobacterium tuberculosis Rv1473. Rv1473 belongs to the ABC subfamily and contains the NBD domain, which can combine and hydrolyze ATP and predict bioinformatics. It may be a macrolide efflux pump. In order to study the function of Rv1473 protein, we first constructed the overexpressed strain of Rv1473 gene in Escherichia coli, expressed and purified the Rv1473 recombinant protein. The ATPase detection kit found that the recombinant protein of Rv1473 can be combined with ATP and has a high ATPase activity, indicating that Rv1473 may be water. The solution of ATP provides energy for the transmembrane transport of material. Fast growing and non-toxic Mycobacterium tumefaciens are ideal models for the study of pathogenic mycobacteria. MSMEG_3140 and Rv1473 are homologous genes, and the amino acid sequences of the encoded proteins are more than 80%. We constructed a Mycobacterium foul Mycobacterium MEMEG_31 by homologous recombination. The 40 gene knockout strain (delta MSMEG_3140) and the remedial strain (delta MSMEG_3140:: Rv1473) were constructed. We found that the wild type, the delta MSMEG_3140 deletion strain was more sensitive to the macrolide, and the missing strain accumulated more EB in the same time, and the remedial strain could be restored to the wild phenotype, which indicates that Rv1473 may be in the large ring. We used RT-PCR to detect the transcriptional level of MSMEG_3140 in macrolide treatment, and we found that MEMEG_3140 was up regulated under macrolide treatment. According to the transcriptional data, the expression of Rv1473 was up regulated by roxithromycin, a member of the macrolide family, in order to verify this result. The activity of Rv1473 promoter under the macrolide treatment was measured, and the promoter activity was found to be enhanced. The above results showed that Rv1473 was a macrolide efflux pump. In addition, it was reported that the outer row pump protein may be involved in the formation of biofilm. We have measured the biofilm of the wild type, the deletion type and the supplement type. There is no significant difference in formation ability, indicating that Rv1473 may not participate in the formation of.Rv1473 and ctpD, trxA, trxB, echA12 and Rv1473A in Mycobacterium tumefaciens biofilm. We speculate that Rv1473 may cooperate with ctpD to complete the transmembrane trans membrane transport of macrolides, which can be involved in whiB7 mediated Mycobacterium tuberculosis in the large ring. During the natural resistance regulation of esters, this paper first revealed that Rv1473 is a new macrolide efflux pump. The results of the preliminary study will provide a reference for the development of the target related inhibitors for the external exhaust pump.
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R378.911

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本文編號：1979716