本文選題：基因剔除 + 模型小鼠��； 參考：《皖南醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：第一部分ApoM基因剔除小鼠模型的構(gòu)建目的：Crispr/Cas9技術(shù)是用于靶向編輯細(xì)胞和動(dòng)物基因組的重要方法。為探究ApoM對糖代謝的影響,本研究采用Crispr/Cas9技術(shù)構(gòu)建ApoM基因敲除的雜合子小鼠模型(ApoM+/ 小鼠),將其與野生型的C57BL/6J(ApoM~(+/+)小鼠)小鼠進(jìn)行合籠繁育,獲得敲除ApoM基因的純合子小鼠模型(ApoM~( / )小鼠)。方法：利用基因組靶向編輯技術(shù)Crispr/Cas9,針對ApoM基因外顯子ATG之后的共有序列設(shè)計(jì)導(dǎo)向核糖核苷酸(g RNA)。利用Not I位點(diǎn)將Cas9質(zhì)粒線性化,分別通過相應(yīng)的試劑盒在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并純化,將純化后的樣品稀釋后注射到來自C57BL/6J雌鼠的受精卵的胞質(zhì)中,并將受精卵移植到同品系假孕小鼠輸卵管內(nèi)。待孕鼠產(chǎn)仔后,剪尾進(jìn)行基因型鑒定。根據(jù)測序結(jié)果,選取基因序列移碼的小鼠與野生型小鼠交配,獲得子代小鼠,經(jīng)尾基因型鑒定,并根據(jù)測序結(jié)果驗(yàn)證ApoM基因是否敲除成功,后續(xù)通過建模成功的小鼠進(jìn)行繁育獲得敲除ApoM基因的純合子模型小鼠。并分別從RNA水平、DNA水平、蛋白表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：利用Crispr/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建敲除ApoM基因的雜合子模型小鼠,通過建模成功的小鼠后續(xù)有選擇性的繁育獲得純合子小鼠。結(jié)論：Crispr/Cas9技術(shù)能夠構(gòu)建ApoM基因剔除的雜合子模型小鼠,ApoM基因剔除其遺傳表型能穩(wěn)定的遺傳給后代。第二部分ApoM基因剔除后小鼠組織形態(tài)變化及其對胰島素信號通路的影響目的：探究ApoM基因剔除后小鼠組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及ApoM基因剔除對胰島素代謝通路PI3K、MAPK、AMPK信號通路的影響。方法：以ApoM~(+/+)小鼠和ApoM~(+/+)AML12細(xì)胞為對照。1.采用全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分析ApoM-/-小鼠基因表達(dá)譜的改變。2.利用光學(xué)顯微鏡和電子透射顯微鏡觀察ApoM-/-小鼠心、肝、腎、胰、睪丸、附睪、脂肪、肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。3.采用Crispr/Cas9技術(shù)構(gòu)建ApoM~( / )AML12細(xì)胞模型,利用油紅O染色檢測ApoM~( / )的AML12細(xì)胞內(nèi)脂代謝情況。4.采用Western blot技術(shù)檢測ApoM~( / )小鼠和ApoM~( / )AML12細(xì)胞內(nèi)Ins R/IRS/PI3K/AKT信號通路上游蛋白IRS1、IRS2、IRS3、IRS4及下游蛋白PDK-1、AKT、GSK3;MAPK信號通路Raf、MAPK、ERK蛋白;AMPK信號通路IRS、Enos、AKT、rab-GTP、AS160蛋白的表達(dá)水平及磷酸化水平。結(jié)果：1.全基因表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)ApoM~( / )小鼠較ApoM~(+/+)小鼠基因表達(dá)譜發(fā)生改變,包括204對上調(diào)基因和204對下調(diào)基因。2.HE染色顯示ApoM~( / )小鼠較ApoM~(+/+)小鼠肝組織細(xì)胞脂肪變性明顯,脂滴增多較為明顯,有少量的炎性細(xì)胞浸潤;胰島數(shù)量明顯減少,胰島體積變小,與周圍組織邊界不清晰,部分胰島萎縮消失。胰島細(xì)胞變性水腫,胰島細(xì)胞減少,胰島有少量出血,胰腺間質(zhì)充血;脂肪細(xì)胞明顯增大,部分脂肪細(xì)胞相互融合。電鏡顯示ApoM~( / )小鼠肝組織糖原堆積明顯增加,儲(chǔ)脂細(xì)胞明顯增大,脂滴增多,線粒體腫脹明顯;腎組織在腎小管區(qū)有脂滴存在,腎小球足細(xì)胞增生;肺組織的肺間膈內(nèi)有脂滴沉積。3.ApoM~( / )AML12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積。4.ApoM-/-小鼠肝組織P-IRS1/2、IRS4、PI3K、P-AKT、PDK1、AS160蛋白表達(dá)降低;P-c-Raf蛋白表達(dá)明顯降低,GSK3β、P-ERK蛋白表達(dá)增加;ampk蛋白表達(dá)增加。結(jié)論：1.ApoM~( / )小鼠其糖脂代謝重要組織(肝、胰、腎、肺)結(jié)構(gòu)變化明顯,有脂質(zhì)和糖原沉積,脂肪細(xì)胞增大,且ApoM~( / )AML12細(xì)胞內(nèi)也呈現(xiàn)脂質(zhì)堆積現(xiàn)象,提示ApoM可能參與糖脂代謝。2.ApoM可能通過影響胰島素代謝通路PI3K、MAPK、AMPK信號通路中的相關(guān)蛋白表達(dá)而參與糖脂代謝。
[Abstract]:絎竴閮ㄥ垎ApoM鍩哄洜鍓旈櫎灝忛紶妯″瀷鐨勬瀯寤虹洰鐨勶細(xì)Crispr/Cas9鎶，

本文編號：1977314