本文選題：miR-146a + 初始T細胞�。� 參考：《天津醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的研究miR-146a對Th17細胞分化過程和功能的影響并探索可能的調控機制,為調控Th17細胞參與的免疫應答尋找新方法。方法應用磁珠法分選小鼠脾臟CD4+CD25-初始T細胞,流式細胞術檢測目的細胞的純度;應用抗小鼠CD3/CD28單克隆抗體刺激CD4+CD25-初始T細胞活化增殖后,用miR-146a agomir和antagomir試劑轉染調控CD4+CD25-初始T細胞中miR-146a表達水平,實驗設置為上調組、下調組以及空白對照組,根據(jù)課題組前期實驗結果,每組分別設置不同轉染濃度亞組,并選取最佳轉染濃度;根據(jù)文獻選取3個不同濃度的IL-6、TGF-β、抗小鼠IL-4抗體以及抗小鼠IFN-γ抗體組合誘導CD4+CD25-初始T細胞向Th17細胞方向分化,驗證各方案的誘導效果并選取最佳誘導方案;流式檢測各組Th17細胞數(shù)目并用ELISA方法檢測各組細胞培養(yǎng)體系上清中IL-17水平,QRT-PCR和Western-blot方法檢測篩選出的miR-146a可能發(fā)揮作用的靶基因的轉錄及蛋白表達水平。結果1.磁珠分選前小鼠脾臟CD4+CD25-初始T細胞的比例為24.9%;磁珠分選后CD4+CD25-初始T細胞純度為92.3%,細胞活性可達到98%。2.成功轉染調控CD4+CD25-初始T細胞中mi R-146a的表達水平,并且成功誘導CD4+CD25-初始T細胞向Th17細胞方向分化。3.用最佳濃度miR-146a調控試劑轉染以及最佳濃度誘導后,上調組、下調組與空白對照組相比Th17細胞數(shù)目和上清中IL-17水平不同。流式細胞學檢測結果提示,上調組較下調組及空白對照組Th17數(shù)目顯著增多(P0.01),下調組較空白組Th17細胞數(shù)目明顯減少(P0.01);ELISA檢測結果顯示,上調組較下調組及空白對照組上清中IL-17水平顯著升高(P0.01),下調組較空白對照組上清中IL-17水平明顯降低(P0.01)。4.QRT-PCR和Western blot結果提示,Th17細胞關鍵轉錄因子ROR-γt和IL-17基因的mRNA和蛋白表達水平在上調組與下調組和空白對照組相比,明顯升高(P0.01),在下調組顯著降低(P0.01);STAT1的表達水平在各組無明顯差異(P0.05);IRAK1表達水平在上調組較下調組和空白組明顯增高(P0.01);在下調組中其表達水平明顯降低(P0.01)。結論1.CD4+CD25-初始T細胞中mi R-146a的表達水平與Th17細胞的分化及其分泌的IL-17水平呈平行關系,miR-146a表達上調可以促使Th17細胞數(shù)目及IL-17分泌量增多;而miR-146a的表達下調后,Th17細胞數(shù)目以及IL-17分泌量也顯著降低。2.在Th17參與的炎性環(huán)境中,調控miR-146a表達水平后,其靶基因之一STAT1的表達水平無顯著變化;miR-146a與另一個靶基因IRAK1不再是負性調控關系,miR-146a表達上調后,IRAK1的表達水平也隨之升高,這可能與促進Th17細胞的分化及其分泌IL-17能力的有關。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of miR-146a on the differentiation process and function of Th17 cells and to explore the possible regulatory mechanism, and to find a new method for regulating the immune response of Th17 cells. Methods CD4 CD25- initial T cells were isolated from mouse spleen by magnetic bead method, the purity of target cells was detected by flow cytometry, and the activation and proliferation of CD4 CD25- initial T cells were stimulated by monoclonal antibody against mouse CD3/CD28. MiR-146a agomir and antagomir reagents were used to transfect and regulate the expression of miR-146a in CD4 CD25- initial T cells. The cells were divided into three groups: up-regulation group, down-regulation group and blank control group. According to the results of previous experiment, each group was divided into different transfection concentration subgroups. Three different concentrations of IL-6 TGF- 尾, anti-mouse IL-4 antibody and anti-mouse IFN- 緯 antibody combination were selected to induce the differentiation of CD4 CD25- initial T cells into Th17 cells. Verify the induction effect of each scheme and select the best induction scheme; Flow cytometry was used to determine the number of Th17 cells in each group and ELISA method was used to detect the level of IL-17 in the supernatant of cell culture system. QRT-PCR and Western-blot methods were used to detect the transcriptional and protein expression of the target genes that miR-146a might play a role in. Result 1. The percentage of CD4 CD25- initial T cells in mouse spleen was 24.9before magnetic bead sorting, and the purity of CD4 CD25- initial T cell was 92.3g after magnetic bead sorting. The expression of mi R-146a in CD4 CD25- initial T cells was successfully regulated by transfection, and the differentiation of CD4 CD25- initial T cells into Th17 cells was induced successfully. The number of Th17 cells and the level of IL-17 in supernatant of up-regulated group and down-regulated group were different from those of blank control group after transfection and induction with the best concentration of miR-146a regulatory reagent. The results of flow cytometry showed that the number of Th17 in the up-regulated group was significantly higher than that in the down-regulated group and the blank control group, and the number of Th17 cells in the down-regulated group was significantly decreased than that in the blank group. The level of IL-17 in supernatant of down-regulated group and blank control group was significantly higher than that of control group, and the level of IL-17 in supernatant of down-regulated group was significantly lower than that of blank control group. 4. The results of RT-PCR and Western blot indicated that mRNA and protein of ROR-緯 t and IL-17 gene in Th17 cells were significantly decreased by RT-PCR and Western blot. Compared with the down-regulated group and the blank control group, the expression level was higher in the upregulation group. In the down-regulated group, there was no significant difference between the two groups in the expression of P0.05 and IRAK1. The expression level of IRAK1 in the up-regulated group was significantly higher than that in the down-regulated group and the blank group, and the expression level in the down-regulated group was significantly lower than that in the down-regulated group. The expression level of IRAK1 in the down-regulated group was significantly lower than that in the down-regulated group. Conclusion the expression level of miR-146a in 1.CD4 CD25- initial T cells is parallel to the differentiation of Th17 cells and the level of IL-17 secreted by Th17 cells. Upregulation of miR-146a expression can increase the number of Th17 cells and the secretion of IL-17. After down-regulation of miR-146a expression, the number of Th17 cells and the secretion of IL-17 decreased significantly. In the inflammatory environment involved in Th17, the expression level of STAT1, one of its target genes, did not change significantly after regulating the level of miR-146a expression. The expression of simiR-146a and another target gene IRAK1 was no longer a negative regulatory relationship. The expression level of IRAK1 increased after the up-regulation of the expression of miR-146a. This may be related to promoting the differentiation of Th17 cells and their ability to secrete IL-17.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1968699