發(fā)布時間：2018-05-29 10:40

  本文選題：CYP24A1 + IL-6　； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文

【摘要】：第一部分:CYP24A1參與炎癥因子調(diào)控Wnt信號通路的機制研究目的:CYP24A1編碼1,25-雙羥維生素D3特異性代謝酶,對1,25-雙羥維生素D3局部組織濃度有決定性影響,后者能夠下調(diào)Wnt/β-catenin通路活化程度。CYP24A1在結(jié)腸息肉與結(jié)腸癌中有異常高表達,其SNP分布也與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病相關(guān)。細胞因子IL-6和TNF-α的活化和NF-κB通路的激活在炎癌轉(zhuǎn)化過程中起到關(guān)鍵作用,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α可通過NF-κB通路調(diào)控Wnt/β-catenin通路活化。有研究報道,IL-6和TNF-α能夠誘導CYP24A1轉(zhuǎn)錄增多,但對蛋白含量影響尚不明確,且CYP24A1基因的表達調(diào)控是否參與IL-6或TNF-α通過NF-κB通路調(diào)控Wnt/β-catenin通路活化尚無相關(guān)研究。本研究旨在探討CYP24A1在IL-6和TNF-α通過NF-κB通路調(diào)控Wnt通路過程中的作用,進一步明確炎癥與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系與具體機制,為特異性抑制CYP24A1酶活性、增加結(jié)腸組織對1,25-雙羥維生素D3抑癌作用敏感性在預防UC癌變中的應用提供了研究基礎。方法:本研究將細胞因子IL-6和TNF-α作用于結(jié)腸癌細胞株HCT-116、Caco-2,使用Western Blot檢測對CYP24A1蛋白表達的影響,使用凝膠遷移實驗(EMSA)檢測對NF-κB通路活化程度的影響,使用Western Blot檢測NF-κB通路特異性抑制劑PDTC對IL-6和TNF-α誘導CYP24A1表達的影響;利用siRNA敲減CYP24A1表達后,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測IL-6和TNF-α對Wnt信號通路調(diào)控作用的變化,使用Western Blot檢測細胞核β-catenin蛋白水平。結(jié)果:IL-6與TNF-α作用于Caco-2和HCT-116細胞可使CYP24A1表達量增加,且表現(xiàn)為時間、劑量依賴。在Caco-2細胞系選取IL-6 100ng/ml、TNF-α50ng/ml 分別作用 6h,HCT-116 細胞系選取 IL-6 50ng/ml、TNF-α100ng/ml 分別作用6h,NF-κB通路活化程度增加,使用NF-κB通路特異性抑制劑PDTC可明顯抑制IL-6與TNF-α對CYP24A1表達的誘導作用。利用siRNA敲減CYP24A1表達可部分拮抗IL-6和TNF-α誘導的β-catenin核內(nèi)分布增多以及Wnt通路活化(相對熒光素酶活性Caco-2細胞系IL-6 3.297±0.1610 vs 2.527±0.03323,p=0.0221;TNF-α 4.130±0.4289 vs 2.780±0.3092,p=0.0249;HCT116 細胞系 IL-6 1.357±0.03422 vs1.086±0.07545,p=0.0048;TNF-α2.374±0.1955 vs 1.802±0.06163,p=0.0313)。結(jié)論:在Caco-2和HCT-116細胞系中,IL-6和TNF-α可能通過誘導NF-κB通路活化進一步促進CYP24A1表達量增加,促進核內(nèi)β-catenin增多,上調(diào)Wnt通路活化程度。第二部分:潰瘍性結(jié)腸炎癌變模型小鼠中CYP24A1基因表達與炎癥因子的關(guān)系目的:本實驗通過建立AOM聯(lián)合DSS小鼠UC癌變模型,給予阻斷炎癥因子TNF-α、NF-κB處理,探究炎癥相關(guān)途徑在UC癌變中對CYP24A1表達的影響。方法:將C57BL/6小鼠隨機分為4組,第1組為空白對照組,第2-4組建立UC癌變小鼠模型(腹腔注射12.5mg/kg AOM,1周后給予2.5%DSS的飲用水,連續(xù)5天,之后換成普通飲用水),其中,第2組為模型對照組,第3組給予NF-κB反義寡聚核苷酸每兩周一次灌腸,第4組給予TNF-α單克隆抗體每兩周一次腹腔注射。12周后處死小鼠,統(tǒng)計瘤負荷,進行病理學評估,使用免疫組化方法檢測CYP24A1表達情況。結(jié)果:CYP24A1表達在模型對照組(n=8,2.500±0.3273)中較空白組(n=6,1.167±0.1667)升高(p=0.0067)。NF-κB反義寡聚核苷酸組的瘤負荷(n=5,1.130±0.1678cm)較模型對照組(n=8,2.294±0.3638 cm)顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(p= 0.0354);NF-κB反義寡聚核苷酸組的小鼠結(jié)腸上皮細胞中CYP24A1表達水平顯著下降(1.400 ±0.2449 vs 2.500 ± 0.3273,p=0.0362)。TNF-α單克隆抗體組的瘤負荷(n=5,1.780±0.5142)較模型對照組(n=8,2.294±0.3638)有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(p= 0.4195);TNF-α單克隆抗體組CYP24A1表達水平顯著下降(1.167 ±0.1667 vs 2.500 ±0.3273,p=0.0144)。結(jié)論:AOM/DSS誘導的UC癌變的小鼠模型中CYP24A1表達升高,抑制TNF-α、NF-κB可部分逆轉(zhuǎn)該作用。
[Abstract]:Part one: CYP24A1 participates in the mechanism of Wnt signaling pathways involved in inflammatory factors: CYP24A1 encoding 1,25- dihydroxyvitamin D3 specific metabolic enzyme, which has a decisive influence on the local tissue concentration of 1,25- dihydroxyvitamin D3, and the latter can downregulate the activation degree of Wnt/ beta -catenin pathway in colon polyps and colon cancer. The SNP distribution is also associated with the pathogenesis of ulcerative colitis. The activation of cytokine IL-6 and TNF- alpha and the activation of NF- kappa B pathway play a key role in the process of the transformation of inflammatory cancer. In our previous study, we found that IL-6 and TNF- alpha could regulate the activation of Wnt/ beta -catenin pathway through NF- kappa B pathway. 4A1 transcription is increasing, but the effect on protein content is not clear, and there is no related study on whether the expression of CYP24A1 gene is involved in the regulation of the activation of Wnt/ beta -catenin through the NF- kappa B pathway. The purpose of this study is to explore the role of CYP24A1 in the regulation of IL-6 and TNF- alpha through the NF- kappa pathway. The relationship and specific mechanism between the oncogenesis and the specific mechanism of inhibiting the activity of CYP24A1 enzyme and increasing the sensitivity of colon tissue to the anti cancer effect of 1,25- dihydroxyvitamin D3 in the prevention of UC carcinogenesis. Methods: This study applied the cytokine IL-6 and TNF- alpha to the colon cancer cell line HCT-116, Caco-2, and Western Blot. The effect of detection on the expression of CYP24A1 protein was detected by using gel migration test (EMSA) to detect the effect of NF- kappa B pathway activation. The effect of PDTC on IL-6 and TNF- alpha induced CYP24A1 expression by NF- kappa B pathway inhibitor PDTC was detected by Western Blot. The changes in the regulation of Wnt signaling pathway and the use of Western Blot to detect the level of nuclear beta -catenin protein. Results: the effect of IL-6 and TNF- alpha on Caco-2 and HCT-116 cells can increase the amount of CYP24A1 expression, which is time and dose dependent. IL-6 50ng/ml, TNF- alpha 100ng/ml acts on 6h, NF- kappa B pathway activation, and NF- kappa B pathway specific inhibitor PDTC can significantly inhibit the induction of IL-6 and TNF- alpha on the expression. The luciferase activity Caco-2 cell line IL-6 3.297 + 0.1610 vs 2.527 + 0.03323, p=0.0221; TNF- alpha 4.130 + 0.4289 vs 2.780 + 0.3092, p=0.0249; HCT116 cell line IL-6 1.357 + 0.03422 vs1.086 + 0.07545, p=0.0048; TNF- alpha 2.374 The activation of NF- kappa B pathway can further promote the increase of CYP24A1 expression, promote the increase of beta -catenin in the nucleus and increase the activation degree of Wnt pathway. The second part: the relationship between the expression of CYP24A1 gene expression in the mice with ulcerative colitis canceration model and the relationship between the expression of the inflammatory factors in mice: this experiment was done by establishing the UC canceration model of AOM combined with DSS mice to block the inflammation. Factor TNF- alpha and NF- kappa B were treated to explore the effect of inflammation related pathways on the expression of CYP24A1 in UC carcinogenesis. Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups, the first groups were blank control group, and the 2-4 group established the UC cancerous mice model (peritoneal injection of 12.5mg/kg AOM, 1 weeks after the drinking water for 2.5%DSS, after 5 days, then converted into ordinary drinking water), among them, The second groups were model control group, and the third groups were given NF- kappa B antisense oligodeoxynucleotides once every two weeks. The fourth groups were given TNF- alpha monoclonal antibody to death mice every two weeks after intraperitoneal injection for.12 weeks. The tumor load, pathological evaluation, and immunohistochemical method were used to detect the CYP24A1 expression. Results: CYP24A1 expression in the model control group (n In =8,2.500 + 0.3273), the tumor load (n=5,1.130 + 0.1678cm) of.NF- kappa B antisense oligonucleotide group was significantly higher than that of the blank group (n=6,1.167 + 0.1667). The difference was significantly lower than that of the model control group (n=8,2.294 + 0.3638 cm). The difference was statistically significant (p= 0.0354); the expression level of the colon epithelial cells in the mice of NF- kappa B antisense oligodeoligonucleotide group The tumor load (n=5,1.780 + 0.5142) of.TNF- a monoclonal antibody group (1.400 + 0.2449 vs 2.500 + 0.3273, p=0.0362) decreased significantly compared with model control group (n=8,2.294 0.3638), but the difference was not statistically significant (p= 0.4195), and the level of CYP24A1 expression in TNF- a monoclonal antibody group decreased significantly (1.167 + 0.1667 vs 2.500 + 0.3273, p=0.01). 44) conclusion: the expression of CYP24A1 in AOM/DSS induced UC canceration mice is increased, and the inhibition of TNF- alpha and NF- kappa B partially reverses this effect.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R363

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本文編號：1950575