本文選題：帕金森病 + 內源性神經(jīng)毒素　； 參考：《北京理工大學》2015年博士論文

【摘要】：帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界上第二大神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為損害患者的運動機能，出現(xiàn)靜止性震顫、肌強直、運動緩慢等臨床癥狀，因此嚴重影響患者的生活質量。自從發(fā)現(xiàn)外源性神經(jīng)毒素MPTP可以造成多巴胺能神經(jīng)元特異性死亡之后，內源性MPTP結構類似物越來越受到關注，特別是在腦內由多巴胺代謝生成的兒茶酚胺異喹啉（catecholamine isoquinolines，CAIQs）物質。本實驗室在多年研究基礎上，提出了CAIQs在腦內形成與代謝的假說，其中由氮甲基轉移酶催化salsolinol（Sal）生成氮甲基產(chǎn)物N-methy-salsolinol （NMSal）是造成神經(jīng)毒性顯著增強的關鍵步驟�；诖思僬f，進一步開展內源性神經(jīng)毒素對黑質神經(jīng)元損傷分子機制研究，并發(fā)展早期診斷的生物標志物候選物，將有助于為PD的發(fā)病機制、早期診斷研究提供理論基礎。 本課題圍繞PD中神經(jīng)損傷相關蛋白標志物和疾病早期診斷標志物的候選物研究，開展兩方面的工作：基于Sal氮甲基轉移酶（SNMT）在內源性神經(jīng)毒素形成神經(jīng)元損傷中的關鍵作用，發(fā)展基于質譜技術的多反應監(jiān)測定量方法，以達到對SNMT活性高靈敏度和高選擇性測定和進一步驗證假說的目的，為后續(xù)開展生物標志物的分析檢測建立方法學基礎；另一方面，通過18O標記的定量蛋白質組學方法開展神經(jīng)功能損傷差異蛋白質組學研究，為了解疾病相關的神經(jīng)功能變化提供蛋白質組學的概貌，并通過腦部與外周差異蛋白的相關性分析，為后續(xù)臨床診斷生物標志物的篩選提供參考。主要研究內容和研究結果如下： 1、針對SNMT酶活測定中的產(chǎn)物NMSal，開展基于多反應監(jiān)測（Multiple reactionmonitoring，MRM）技術的兒茶酚異喹啉類化合物NMSal的高靈敏度定量方法。質譜檢測離子對為NMSal （194.1→145.1），方法學的評價表明NMSal的最低檢測限達49pM，最低定量限為98pM，定量范圍在0.098nM~100nM，線性相關系數(shù)大于0.9995，具有較好的日內精密度和日間精密度（均小于15.0%），較好的準確度（94.0%~112.5%），以及較好的方法回收率（81.0%~91.4%），保證了在復雜生物體系中對NMSal的高靈敏度、高選擇性以及高準確性的定量檢測要求。 2、通過對NMSal的定量檢測，測定了6-OHDA單側損毀的PD模型大鼠中SNMT活性。其中PD模型大鼠采用6-OHDA單側損毀紋狀體的方式構建，通過行為學和形態(tài)學的評價結果顯示建模成功率達60%，模型組黑質部位多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目與假手術對照組相比顯著減少（p0.01）。SNMT活性的結果發(fā)現(xiàn)PD模型大鼠紋狀體、黑質和血液淋巴細胞中SNMT活性與假手術對照大鼠相比均顯著升高（紋狀體：p0.05；黑質與淋巴細胞：p0.01），活性在外周淋巴細胞變化趨勢與在腦部變化的趨勢一致，該結果不僅說明SNMT及其活性與CAIQs在腦內形成與代謝有關，而且進一步證實SNMT的活性可能在外周血液中有所反映，有可能作為早期診斷的標志物。 3、開展了抑制off-gel分離中18O標記回標的方法研究。對標準蛋白牛血清白蛋白BSA的考察結果表明，通過超濾去除游離酶后，18O標記的肽段在off-gel分離中沒有出現(xiàn)明顯回標現(xiàn)象，標記效率為95.5±2.5%，肽段的平均回收率為80.6±10.8%，16O與18O標記的肽段混合物1:1混合后的比值為0.99±0.17。此外，生物樣品經(jīng)過超濾法去除游離酶和off-gel分離之后，90%以上的蛋白定量比值為1.04±0.16，滿足定量蛋白質組學的要求，有助于定量蛋白質組學中18O標記方法與off-gel分離的聯(lián)用。 4、采用基于18O標記的二維液相色譜質譜法，對6-OHDA單側損毀的PD模型大鼠中紋狀體和黑質的蛋白進行差異蛋白質組學、及疾病狀態(tài)下神經(jīng)損傷的分子機制的深入研究。紋狀體的蛋白質組學結果顯示當肽段FDR1.0%時，共有1232張肽段-質譜匹配圖，以及370個蛋白得到定性和定量分析，76個蛋白差異表達；黑質的蛋白質組學結果顯示當肽段FDR1.0%時，共有8349張肽段-質譜匹配圖，以及1344個蛋白得到定性和定量分析，93個蛋白差異表達。通過生物信息學軟件分析和文獻對數(shù)據(jù)的支持與解讀，并基于單側損毀的PD模型大鼠中紋狀體和黑質的氧化應激水平增高現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)功能損傷相關的蛋白變化情況主要體現(xiàn)在：（1）參與糖酵解過程的蛋白和線粒體蛋白分別表達上調和表達下調，包括紋狀體中7個線粒體蛋白表達下調，3個參與糖酵解過程的蛋白表達上調，黑質中5個線粒體蛋白表達下調，3個參與糖酵解過程的蛋白表達上調，與PD密切相關的這兩個腦區(qū)中均顯示出糖酵解和線粒體功能的蛋白水平協(xié)同的差異表達，提示疾病過程中的能量代謝發(fā)生障礙，線粒體功能受損，ATP供能不足，糖酵解過程的蛋白表達上調以發(fā)揮能量代償作用；（2）紋狀體中22個下調蛋白是囊泡組分，含10個參與神經(jīng)元囊泡的傳遞和回收組分，這些蛋白構成以SNARE復合體為核心的突觸蛋白及其附屬蛋白，和以網(wǎng)格蛋白介導的胞吞過程相關蛋白，并對突觸融合蛋白（syntaxin-1A）進行了生物學驗證，與質譜結果一致，表明6-OHDA單側損毀的PD大鼠模型中，其紋狀體的胞吞胞吐功能受損，參與了疾病的發(fā)病進程；（3）黑質的差異表達蛋白顯示13個蛋白在免疫應答生物學過程中顯著聚集，包括小膠質細胞發(fā)生細胞活化和增殖的蛋白3個、炎癥反應與免疫蛋白8個、維持鈣平衡和神經(jīng)保護作用的蛋白2個，其中對血清白蛋白（serum albumin）進行生物學驗證，驗證結果與質譜結果一致，免疫相關蛋白的差異表達提示隨疾病進程中關鍵病變區(qū)的免疫功能異常。 5、基于18O標記的差異蛋白質組學對6-OHDA單側損毀的PD大鼠模型中血液淋巴細胞的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞中參與糖酵解過程的蛋白表達上調，免疫應答相關的蛋白表達上調，此外，與假手術對照組相比，PD模型組的大鼠白細胞數(shù)目和淋巴細胞數(shù)目極顯著增加（p0.01），表明疾病狀態(tài)下機體存在炎癥反應，對大鼠的外周血淋巴細胞進一步的細胞亞群分型可以發(fā)現(xiàn)，CD4+/CD8+的比值降低（p0.01），提示疾病進程中機體活躍的免疫反應，存在免疫功能異常，并且主要是由T輔助細胞（CD4+）的百分比降低所致；外周和腦部差異蛋白的相關性分析結果發(fā)現(xiàn)共17個蛋白在淋巴細胞和黑質部位差異表達，相關系數(shù)為0.45，說明這17個差異蛋白在外周和腦部的變化具有一致性，存在一定的相關程度，其中在外周與腦部的表達均為上調的差異蛋白共7個，變化趨勢的相關系數(shù)為0.89，進一步說明外周與腦部差異蛋白表達水平的趨勢一致，相關程度增加，外周淋巴細胞蛋白的變化能夠反映出腦部的蛋白變化，同時主成分分析可以發(fā)現(xiàn)，果糖二磷酸醛縮酶A、甘油醛3-磷酸脫氫酶、6-磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶在淋巴細胞中表達上調，在黑質中無明顯差異表達，提示疾病發(fā)生過程中，，外周淋巴細胞對能量需求的敏感性高，以發(fā)揮其免疫監(jiān)視、免疫應答的作用，纖維蛋白原、血清白蛋白、補體C3、轉凝蛋白-2和α-輔肌動蛋白均表現(xiàn)為外周與腦部表達上調的趨勢，并且蛋白變化的相關系數(shù)為0.95，提示免疫功能相關蛋白參與了疾病的發(fā)病進程，表現(xiàn)為外周和腦部均存在免疫反應，其蛋白水平能夠反映外周與腦部變化趨勢，可為后續(xù)臨床診斷指標提供研究基礎和候選參考。 綜上所述，基于質譜技術手段，不僅能夠準確定量單一目標，也能反映生物機體內整體蛋白質的表達情況概貌。從蛋白質的水平表征疾病進程中的變化，包括神經(jīng)功能損傷和疾病標志物的研究，對提高早期診斷的正確率、合理分類亞型、監(jiān)測病情進展和評估神經(jīng)保護治療的療效具有重要作用，可作為后續(xù)研究的參考。
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【學位授予單位】：北京理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5;R-332

【參考文獻】

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1 王冉;慶宏;劉曉茜;鄭曉琳;鄧玉林;;鐵離子促進過量多巴胺引起SH-SY5Y細胞兒茶酚異喹啉物質生成和氧化損傷(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2008年03期

本文編號：1939134