發(fā)布時間：2018-05-26 14:57

  本文選題：蛋白質化學合成 + 一鍋法多片段縮合��； 參考：《清華大學》2016年博士論文

【摘要】：蛋白質化學合成是人工獲取生物技術難以獲得的蛋白質的有效手段。它能夠在原子精度層面實現對蛋白質的任意改造,提供定點翻譯后修飾(甲基化,乙�；�,磷酸化,泛素化等)蛋白質,對不同物理刺激(光,磁等)響應的蛋白質探針,以及蛋白質藥物用于生命科學和生物醫(yī)學研究。特別地,化學合成光控蛋白質探針能夠高時空分辨的控制蛋白質的活性,而被廣泛應用于研究高度動態(tài)的生命過程,比如細胞的定向運動,細胞內的信號傳導等。然而,蛋白質化學合成還需要進一步發(fā)展方法以提高蛋白質合成的效率,并進一步擴展化學合成的蛋白質在生命科學的應用。本論文將介紹作者在博士期間發(fā)展的高效率化學合成蛋白質的新方法,及化學合成光控蛋白質探針在研究免疫細胞信號傳導機制的應用。蛋白質化學合成近期的一個重要的方法進展就是發(fā)展一鍋法多肽片段連接技術,克服由分離純化連接中間產物帶來的產率低和耗時費力的問題,以提高蛋白質化學合成的效率。雖然一鍋法三片段連接技術已經被建立,卻沒有有效的一鍋法更多片段(比如四片段)的縮合策略。本論文作者發(fā)展了一種穩(wěn)健而高效的,基于對pH值敏感的新型N端Cys保護基——三氟乙酰氨甲基(Tfacm)的一鍋法四片段蛋白合成策略。利用該策略,本論文作者成功的實現了一鍋法四片段合成模型蛋白Crambin和人源趨化因子hCCL21�；赥facm的一鍋法四片段化學合成蛋白質的策略,為化學合成更大,更復雜的蛋白質提供一種有力的手段。在發(fā)展蛋白質化學合成方法的基礎上,本論文作者發(fā)展了高時空分辨的系統研究免疫細胞定向運動和活化早期的信號傳導過程。作者化學合成雙光子光控的趨化因子探針(hCCL5**),通過體外雙光子解籠鎖(0.1μm2)及共聚焦顯微鏡單細胞成像技術,證明了PI3K在T細胞趨化運動過程中不決定方向的感知,而影響細胞的持續(xù)性運動。同時,作者在小鼠表皮和淋巴組織內首次實現了利用雙光子激活的探針hCCL5**人為的控制T細胞的運動和分布。此外,作者化學合成了光控蛋白抗原探針(HEL-K_(96)NPE),實現了光掩蔽極強相互作用(20 pM結合力)和極大相互作用面(1800?2)的抗體(HyHEL-10)-抗原(HEL)相互作用。并通過全內反射熒光顯微鏡(TIRFM),實現了對B細胞活化早期B細胞受體微簇形成和鈣離子震蕩反應等信號傳導的動力學測量。這些光控蛋白探針為進一步理解和調控免疫細胞的功能提供了高分辨的分子工具。
[Abstract]:Protein chemical synthesis is an effective method to obtain protein which is difficult to be obtained by biological technology. It can transform proteins arbitrarily at the atomic precision level, providing fixed-point post-translational modification (methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitin, etc.) proteins, protein probes that respond to different physical stimuli (light, magnetism, etc.). And protein drugs for life sciences and biomedical research. In particular, chemically synthesized photo-controlled protein probes can control the activity of proteins in high spatial and temporal resolution, and are widely used to study highly dynamic life processes, such as cell directional movement, intracellular signal transduction, and so on. However, protein chemical synthesis needs to be further developed to improve the efficiency of protein synthesis, and to further expand the application of chemically synthesized proteins in the life sciences. This paper will introduce a new method of high efficiency chemical synthesis of proteins developed by the author during his Ph.D. and the application of chemically synthesized photo-controlled protein probes in studying the mechanism of signal transduction in immune cells. One of the most important methods of protein chemical synthesis is the development of one-pot peptide fragment binding technology to overcome the problems of low yield and time-consuming caused by the separation and purification of ligated intermediate products in order to improve the efficiency of protein chemical synthesis. Although the one pot three fragment linking technique has been established, there is no effective condensation strategy for more fragments (e. G. Four fragments) in one pot method. In this paper, the authors have developed a stable and efficient one-pot four-fragment protein synthesis strategy based on a novel N-terminal Cys protection group, trifluoroacetamethylammonium trifluoroacetylmethyl (Tfacm), which is sensitive to pH value. Using this strategy, the author successfully implemented the one-pot four-fragment synthesis of model protein Crambin and human chemokine hCCL21. The strategy of one-pot four-fragment chemical synthesis of proteins based on Tfacm provides a powerful means for chemical synthesis of larger and more complex proteins. On the basis of the development of protein chemical synthesis methods, the authors have developed a high space-time resolution system to study the early signal transduction processes of immune cells during their directional movement and activation. The authors have synthesized a chemically controlled chemokine probe hCCL5, using in vitro two-photon cage locking (0.1 渭 m ~ 2) and confocal microscope single cell imaging technique. The results show that PI3K does not determine the direction of T cell chemotaxis. And affects the cell's sustained movement. At the same time, in mouse epidermis and lymphoid tissues, the authors have for the first time realized the artificial control of T cell movement and distribution by using a two-photon activated probe hCCL5 *. In addition, the authors have chemically synthesized a photo-controlled protein antigen probe, HEL-KH _ (96) NPE, which realizes the interaction of the highly photomasking interaction (20 pm) and the maximal interaction surface (1800 ~ (2) with the antibody HyHEL-10 (antigen-hele). The kinetic measurements of signal transduction such as the formation of B cell receptor microclusters and Ca 2 + oscillation reaction in the early stage of B cell activation were carried out by means of total internal reflection fluorescence microscope (TIR). These light-controlled protein probes provide a high-resolution molecular tool for further understanding and regulating the function of immune cells.
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392;O657.3

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本文編號：1937657