本文選題：Toll + 樣受體�。� 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景與目的:膿毒癥流行病學(xué)調(diào)查研究顯示全球每年有1800萬膿毒癥患者,死亡率高達(dá)30%~50%,如并發(fā)感染性休克,患者的病死率可高達(dá)80%。因此,探索膿毒癥發(fā)病機(jī)制,研究膿毒癥的拮抗藥物或治療措施,對膿毒癥患者的救治具有重要的意義。細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲等都可以引起膿毒癥的發(fā)生,而革蘭陰性菌仍是膿毒癥發(fā)生的主要因素,侵入血中革蘭陰性菌大量繁殖、死亡崩解釋放的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),在胞外經(jīng)一系列信號傳遞,最終通過TLR4將信號傳遞到胞內(nèi),引起炎癥因子的釋放,因而TLR4是LPS誘發(fā)膿毒癥的樞紐,在膿毒癥發(fā)生中發(fā)揮了重要作用,也成為膿毒癥治療藥物研究的重要靶點(diǎn)。目前有關(guān)TLR4的抗體研究表明通過抑制TLR4能夠抑制炎癥因子的釋放及降低動(dòng)物的死亡率,然而,傳統(tǒng)單克隆抗體存在組織穿透能力弱、生產(chǎn)成本及臨床應(yīng)用價(jià)格高昂等問題,在一定程度上限制了單克隆抗體的臨床應(yīng)用。基于駱駝重鏈抗體發(fā)現(xiàn)而開展的納米抗體研究,為抗體藥物進(jìn)行疾病診斷、治療提供新的途徑。不同于傳統(tǒng)四鏈抗體(包含兩條重鏈和兩條輕鏈),駱駝重鏈抗體在輕鏈缺失的情況下單獨(dú)存在,同時(shí)駱駝重鏈抗體的可變區(qū)(Variable domain of the heavy chain,VHH)單個(gè)結(jié)構(gòu)同樣能夠結(jié)合抗原,展示出良好的抗體活性,其結(jié)構(gòu)呈橢圓形,直徑2.5nm,高4nm,由于其大小在納米物質(zhì)規(guī)定的100nm內(nèi),因此將駱駝重鏈抗體VHH也稱為納米抗體(Nanobody,Nb)。納米抗體由于具有分子小,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、組織穿透能力強(qiáng)、可溶性高、易于制備、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn),展示了很好的應(yīng)用前景�；诩{米抗體應(yīng)用方面的優(yōu)勢及TLR4在介導(dǎo)膿毒癥LPS信號傳遞過程中的重要作用,本研究擬通過TLR4胞外區(qū)抗原表達(dá)純化、噬菌體抗體庫展示技術(shù),進(jìn)行抗TLR4納米抗體的制備,并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)LPS、細(xì)菌性膿毒癥模型實(shí)驗(yàn),探討抗TLR4納米抗對膿毒癥大鼠的保護(hù)作用。研究方法:1.TLR4結(jié)構(gòu)分析,選擇TLR4胞外區(qū),通過基因擴(kuò)增、載體構(gòu)建技術(shù)將TLR4的胞外區(qū)構(gòu)建到原核表達(dá)載體p ET28a,通過純化得到高純度TLR4胞外區(qū)(ex-TLR4)。2.將純化TLR4胞外區(qū)作為免疫原,于第0、14、28、42、56、70、84天,皮下多點(diǎn)抗原注射500μg/次,進(jìn)行駱駝免疫,免疫后第7天采血進(jìn)行抗體效價(jià)檢測。采集高效價(jià)免疫駱駝外周血并分離淋巴細(xì)胞,擴(kuò)增VHH,將VHH構(gòu)建到p Cantab-5E噬菌體展示系統(tǒng),電轉(zhuǎn)入TG1宿主菌,并計(jì)算庫容。3.ex-TLR4包被進(jìn)行四輪淘洗,從第四輪淘洗后的納米抗體庫中隨機(jī)挑取60個(gè)克隆,ex-TLR4包被,噬菌體ELISA篩選,將篩選到的陽性克隆,利用前期純化的TLR4中間結(jié)構(gòu)域(TI)、TLR4 C端結(jié)構(gòu)域(TC)繼續(xù)二次篩選,獲得的陽性克隆,轉(zhuǎn)化HB2151宿主菌,乳糖自動(dòng)誘導(dǎo)進(jìn)行納米抗體的表達(dá)、純化,獲得納米抗體分別命名為:TI-Nbs、TC-Nbs。4.體外通過LPS對NR8383細(xì)胞的刺激,加入制備的抗TI、TC結(jié)構(gòu)域納米抗體,ELISA觀察納米抗體對脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子(TNF-α、IL-6)釋放的影響。5.體內(nèi)分別通過LPS和革蘭陰性菌細(xì)菌模型,觀察抗TI、TC納米抗體對動(dòng)物存活率的影響。研究結(jié)果:1.選擇TLR4胞外區(qū)序列,成功構(gòu)建表達(dá)載體并獲得高純度的胞外區(qū)蛋白。2.ex-TLR4免疫駱駝,四次免疫后效價(jià)達(dá)到1:128000,采集外周血淋巴細(xì)胞,VHH構(gòu)建到p Cantab-5E噬菌體展示系統(tǒng)建庫,庫容可達(dá)109。3.抗體庫經(jīng)四輪淘洗,第三輪富集倍數(shù)達(dá)到147倍,第四輪富集3.1倍,四輪淘選后抗體庫達(dá)到富集,經(jīng)ex-TLR4篩選獲得16個(gè)陽性克隆,TI、TC二次篩選分別獲得5個(gè)、7個(gè)陽性克隆,獲得陽性克隆進(jìn)一步自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以包涵體和可溶兩種形式存在,可溶性表達(dá)產(chǎn)物純化后純度90%。4.脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型,獲得針對TI的5個(gè)和TC的7個(gè)陽性克隆中,每組分別有3個(gè)和4個(gè)陽性克隆具有抑制細(xì)胞炎癥因子釋放的作用,抗TI納米抗體抑制效果優(yōu)于抗TC納米抗體,兩個(gè)納米抗體的協(xié)同作用能進(jìn)一步降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。5.選取細(xì)胞活性中和作用最強(qiáng)的納米抗體進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果, LPS炎癥模型組,抗TI、TC納米抗體多次、聯(lián)合給藥的治療效果優(yōu)于單個(gè)納米抗體、單次給藥的治療。細(xì)菌性膿毒癥模型,進(jìn)一步證實(shí)了兩個(gè)納米抗體多次、聯(lián)合給藥的方式,能夠降低TNF-α、IL-6炎癥因子的釋放,并提高大鼠的存活率。結(jié)論:膿毒癥的本質(zhì)是機(jī)體對感染性因素引起的過度免疫反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致大量炎癥因子釋放和組織器官損傷,這一反應(yīng)一旦觸發(fā)即按照自身規(guī)律發(fā)展,并不不依賴感染因素,膿毒癥的發(fā)生與否以及嚴(yán)重程度完全取決于機(jī)體的反應(yīng)。病原體入侵機(jī)體時(shí),依靠模式識(shí)別受體發(fā)揮防御作用,TLRs是天然免疫的主要“開關(guān)”。目前的研究表明,LPS可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞TLR4基因表達(dá)上調(diào),而上調(diào)的TLR4又作為新的受體介導(dǎo)更多的細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)的釋放,在這種正反饋下,炎癥反應(yīng)不斷放大,最終導(dǎo)致發(fā)展為膿毒癥。本研究通過蛋白表達(dá)、純化的方式獲得TLR4胞外區(qū)抗原,噬菌體展示抗體庫制備技術(shù)獲得抗TLR4 C端和中間結(jié)構(gòu)域的納米抗體,體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抗TLR4納米抗體能夠有效降低炎癥因子釋放并提高動(dòng)物的存活率,同時(shí)C端和中間域的同時(shí)封閉,效果更為明顯,為膿毒癥的臨床治療提供了新的思路和策略。
[Abstract]:The research background and purpose : The epidemiological investigation of sepsis shows that there are 18 million patients with sepsis in the world , the mortality rate is as high as 30 % -50 % , such as infection shock , the death rate of the patient can be as high as 80 % . In this study , we studied the protective effects of anti - TLR and TC nano - antibodies on the survival rate of mice induced by lipopolysaccharide ( LPS ) . The results showed that LPS could induce the release of TNF - 偽 and IL - 6 . The results showed that LPS could induce the release of TNF - 偽 and IL - 6 . The phage display antibody library preparation technique obtains the nano - antibodies against the C - terminal and the intermediate domain , in vitro and in vivo experiments prove that the anti - TLR nano - antibody can effectively reduce the release of the inflammatory factor and improve the survival rate of the animals , meanwhile , the C - terminal and the intermediate domain are simultaneously closed , the effect is more obvious , and the new idea and strategy are provided for the clinical treatment of sepsis .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7;R-332

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本文編號：1916392