本文選題：細胞滋養(yǎng)層細胞 + 合體滋養(yǎng)層��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景新生命的孕育始于卵子和精子的結(jié)合。卵子和精子的受精發(fā)生在輸卵管的壺腹部,受精卵在輸卵管向子宮移動的過程中經(jīng)歷卵裂發(fā)育為桑椹胚。在受精后4-5天發(fā)育為囊胚,此時已到達子宮腔,囊胚由位于內(nèi)部的內(nèi)細胞團和外部的滋養(yǎng)外胚層組成,日后滋養(yǎng)外胚層發(fā)育為胎盤,內(nèi)細胞團發(fā)育為胎兒。胎盤是一個臨時性器官,但是在母體整個妊娠過程中起著舉足輕重的作用。胎兒的正常發(fā)育離不開胎盤,胎盤是聯(lián)系母體與胎兒的紐帶,對于母胎的健康至關(guān)重要。胎盤的發(fā)生發(fā)育出現(xiàn)異常則會導致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生,包括子癇前期(pre-eclampsia)、早期流產(chǎn)(first trimester miscarriage)和胎兒發(fā)育遲緩(fetal growth restriction),嚴重時可導致胎兒死亡。因此,胎盤的正常發(fā)育和其功能的正常調(diào)控對于人類妊娠過程中胎兒的正常發(fā)育非常重要。細胞融合是哺乳動物常見的生理過程,它參與受精、胎盤發(fā)育、骨骼肌和骨頭的發(fā)育以及免疫防御反應(yīng)。在卵子和精子結(jié)合的過程中,精子穿過透明帶后繼續(xù)穿過卵細胞的細胞膜,受精卵形成的這個過程發(fā)生了精子與卵細胞的融合。在人類胎盤絨毛發(fā)育過程中,同樣也存在細胞融合事件的發(fā)生。囊胚種植入子宮后,接下來的胎盤發(fā)育開始出現(xiàn)胎盤絨毛。在胎盤絨毛的形成過程中,細胞滋養(yǎng)層細胞主要沿著兩條途徑分化。侵潤遷移途徑：細胞滋養(yǎng)層細胞(cytotrophoblast, CTB)分化為具有侵潤能力的絨毛外滋養(yǎng)層細胞(extravillouscytotrophoblast, EVT)向母體子宮發(fā)生侵潤;融合途徑：胎盤絨毛細胞滋養(yǎng)層細胞中有一類具有增殖分化能力的細胞,這類細胞可分裂為兩個細胞,其中一個與外圍的合體滋養(yǎng)層(syncytiotrophoblast, STB)發(fā)生融合,而另一個細胞繼續(xù)保持有絲分裂特性。在細胞滋養(yǎng)層細胞融合到合體滋養(yǎng)層的過程中,細胞滋養(yǎng)層細胞不僅將其細胞核融進合體滋養(yǎng)層,還有胞質(zhì)中的細胞器包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等所有物質(zhì)都進入了合體滋養(yǎng)層。細胞滋養(yǎng)層細胞不斷持續(xù)融入合體滋養(yǎng)層的這種特性能夠讓合體滋養(yǎng)層的表面積不斷擴大,同時更新現(xiàn)有的合體滋養(yǎng)層,使得合體滋養(yǎng)層中老化的部分代謝到母體血液循環(huán)中完成自身的新陳代謝從而實現(xiàn)胎盤的發(fā)育和成熟。老化的內(nèi)容物和凋亡的物質(zhì)聚在一起形成合體滋養(yǎng)層結(jié)節(jié),這種結(jié)節(jié)將從合體滋養(yǎng)層排放到母體血液中從而維持的合體滋養(yǎng)層穩(wěn)態(tài)。這對于胎兒胎盤的新陳代謝是至關(guān)重要的。如果細胞融合失去控制,導致合體滋養(yǎng)層凋亡或壞死物質(zhì)大量的排到母體血液中則有可能引起母體妊娠炎癥反應(yīng)過度,導致妊娠疾病如子癇前期等的發(fā)生。胎盤是母體與胎兒進行氣體交換、供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和排除代謝產(chǎn)物的場所。大約在受精后第3周末,絨毛內(nèi)的中胚層分化出毛細血管形成三級絨毛,此時開始胎兒胎盤循環(huán)系統(tǒng)的建立。絨毛間隙充滿了由母體子宮螺旋動脈提供的血液,子宮螺旋動脈的血液富含氧氣及胎兒發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。位于絨毛外層的合體滋養(yǎng)層可與子宮螺旋動脈血直接接觸,進行營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物和氣體的交換。同時合體滋養(yǎng)層還可以阻礙來自于母體病原體的進入,如抵抗李斯特細菌等病原體。若合體滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)遭到破壞,來自母體血液的病原體則可能入侵,影響胎兒的生長與發(fā)育。胎盤同時還是一個具有代謝和內(nèi)分泌功能的器官,可合成各種激素,包括絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)、胎盤催乳素(human placental lactogen, hPL)、雌激素、孕激素和胎盤生長因子等。這些分子的正常合成及分泌對于胎盤的正常發(fā)育和功能的發(fā)揮以及妊娠的維持等各個方面起著至關(guān)重要的作用。氣體、營養(yǎng)物質(zhì)在母體與胎兒的正常交換、母體病原體進入胎兒受到的阻礙以及以上激素的正常分泌依賴于合體滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育,形成良好的胎盤屏障結(jié)構(gòu),充分保證了胎兒發(fā)育的正常進行。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition. EMT)是上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有活動能力、能夠在細胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細胞的過程。EMT中最典型的特征是E-cadherin的降低或缺失。研究發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子包括Snail、Slug、 ZEB1、ZEB2以及Twist1可通過抑制E-cadherin的表達促進上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)錄因子被稱為EMT相關(guān)因子。本研究團隊之前已報道Cullin7通過調(diào)控ZEB1和Slug的表達,從而促進胎盤絨毛中滋養(yǎng)層細胞的侵潤遷移,滋養(yǎng)層細胞的EMT轉(zhuǎn)化。其他研究也發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)因子,包括Twist1、Snail和Slug在胎盤絨毛中滋養(yǎng)層細胞的侵潤遷移分化過程中發(fā)揮重要的作用。以上研究表明EMT相關(guān)因子(ZEB1、Twist1、Snail和Slug)在滋養(yǎng)層細胞的侵潤遷移過程中發(fā)揮重要作用,但這些EMT相關(guān)因子在絨毛中滋養(yǎng)層細胞分化的融合途徑中是否也發(fā)揮同樣重要的作用,這方面的研究報道不多。因此,本實驗的研究目的主要是檢測EMT相關(guān)因子在胎盤絨毛中細胞滋養(yǎng)層細胞融合分化途徑中的作用。通過實驗研究我們證實了轉(zhuǎn)錄蛋白Twist1參與了滋養(yǎng)層細胞的融合分化過程,并在其中發(fā)揮著重要的作用。并首次研究發(fā)現(xiàn)了Twist1可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控GCM1的表達從而促進滋養(yǎng)層細胞的融合。EMT相關(guān)因子Twist1不僅在胎盤母胎界面促進上皮.間質(zhì)的轉(zhuǎn)化,在滋養(yǎng)層細胞的另一條分化途徑中(融合途徑)同樣發(fā)揮重要的生理功能。這些研究結(jié)果將有助于我們進一步了解胎盤滋養(yǎng)層融合發(fā)生及胎盤形成的分子機制。深入研究胎盤形成的生理機制為臨床上預(yù)防胎盤發(fā)育異常引起的妊娠相關(guān)疾病提供分子理論基礎(chǔ),更加深入了解妊娠相關(guān)疾病發(fā)生的病理機制,為日后治療妊娠相關(guān)疾病提供更多、更加有效的治療方法。第一部分Twist1在人類胎盤滋養(yǎng)層細胞融合過程中的作用[研究目的]通過檢測EMT相關(guān)分子在人類胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化過程中的表達情況,探討EMT相關(guān)分子在人類胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞融合過程中的作用,有利于我們進一步了解胎盤發(fā)育過程中滋養(yǎng)層細胞的融合分化途徑。[研究方法]2014年5月至2015年5月從北京婦產(chǎn)醫(yī)院收集人類胎盤,包括妊娠早期人工流產(chǎn)絨毛(6-8周)、妊娠中期引產(chǎn)的正常胎盤(18-20周)和足月分娩的胎盤(38-40周)。從足月胎盤中分離原代滋養(yǎng)層細胞,建立原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化模型。原代滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)期間,收集不同時間點的細胞,通過實時定量PCR和蛋白免疫印跡方法檢測p型人絨毛膜促性腺激素(p-hCG)的mRNA水平及蛋白表達水平,運用免疫熒光方法檢測原代滋養(yǎng)層細胞合胞體的形成確定原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化模型的成功建立。利用實時定量PCR檢測EMT相關(guān)因子(Twist1、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2)在原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化過程中的表達變化。運用免疫組化方法檢測EMT相關(guān)因子Twist1在妊娠早期絨毛、妊娠中期胎盤及足月胎盤的表達定位。通過蛋白免疫印跡方法檢測原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化過程中及forskolin (FSK)誘導BeWo細胞融合過程中的Twist1的蛋白表達水平。使用特異性siRNA靶向抑制BeWo細胞中Twist1的表達24小時,隨后FSK誘導BeWo細胞融合48小時。觀察其對FSK處理的BeWo細胞融合過程的影響,包括合胞體的形成及β-hCG的蛋白表達水平。[研究結(jié)果](1)免疫熒光顯示原代滋養(yǎng)層細胞在培養(yǎng)的過程中會自發(fā)聚集形成合胞體。隨著培養(yǎng)時間的延長,滋養(yǎng)層細胞形成的合胞體越大,72小時后合胞體中的細胞核數(shù)可達10個以上。β-hCG的mRNA水平及蛋白表達水平隨著滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化的進程而逐漸升高。(2)實時定量PCR檢測顯示EMT相關(guān)因子Twist1的mRNA水平在原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化過程中其表達顯著性升高,而其他EMT相關(guān)因子(Snail、Slug、ZEB1和ZEB2) mRNA水平顯著性降低。(3)在妊娠不同時期胎盤絨毛中轉(zhuǎn)錄因子Twist1主要表達在細胞滋養(yǎng)層細胞、合體滋養(yǎng)層及絨毛間質(zhì)細胞,具有明顯的核定位信號。(4)Western blotting顯示原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化過程中,Twist1的蛋白表達水平在24小時已明顯升高并持續(xù)至72小時。FSK誘導Be Wo細胞融合過程中,與對照組相比較(DMSO), Twist1的蛋白表達水平升高。(5)特異性siRNA靶向抑制Twist1的表達,與對照組(scrambled siRNA)相比較,FSK處理的BeWo細胞的β-hCG蛋白表達水平降低,形成的合胞體數(shù)減少,融合指數(shù)顯著降低。[研究結(jié)論](1)足月胎盤分離得到的原代滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)過程中滋養(yǎng)層細胞自發(fā)融合形成合胞體,表明了人胎盤原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化模型的成功建立。(2)EMT相關(guān)因子Twist1的mRNA水平及蛋白表達水平隨著原代滋養(yǎng)層細胞自發(fā)合體化的進程而升高,并且在妊娠不同時期的胎盤絨毛中的細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層都有明顯的核定位信號。提示了Twistl可能參與了合體滋養(yǎng)層的形成。(3)利用人絨毛膜癌滋養(yǎng)層細胞系BeWo細胞進行功能實驗,發(fā)現(xiàn)靶向抑制Twistl的表達后,抑制FSK誘導的BeWo細胞融合,融合指數(shù)顯著降低,且合成分泌的β-hCG減少。進一步證實了Twist1在滋養(yǎng)層細胞融合過程中的重要作用。第二部分Twist1通過調(diào)控GCM1表達促進滋養(yǎng)層細胞的融合[研究目的]本課題第一部分已經(jīng)初步證實了在人類胎盤絨毛發(fā)育過程中Twist1可促進細胞滋養(yǎng)層細胞的融合發(fā)生。但目前對于Twist1調(diào)控滋養(yǎng)層細胞發(fā)生融合的作用機制鮮有報道。GCM 1是目前公認的可促進人類胎盤絨毛中細胞滋養(yǎng)層細胞向合體滋養(yǎng)層發(fā)生融合的分子。本部分實驗主要探討Twist1是否通過調(diào)控GCM1表達促進滋養(yǎng)層細胞的融合,研究Twistl促進滋養(yǎng)層細胞融合的分子機制。[研究方法]運用免疫組化方法檢測Twist1和GCM1在人類早期妊娠絨毛中的表達定位。從人類足月胎盤絨毛中分離得到的原代滋養(yǎng)層細胞分別在常氧(20%)和低氧(2%)條件下培養(yǎng)至72小時,培養(yǎng)期間收集不同時間點的細胞,通過實時定量PCR和蛋白免疫印跡方法檢測不同培養(yǎng)條件下Twist1、GCM1和β-hCG的表達情況。使用特異性siRNA靶向抑制BeWo細胞中Twist1的表達,然后FSK誘導BeWo細胞融合48小時。運用實時定量PCR觀察Twist1 siRNA對FSK處理的BeWo細胞融合過程中GCM1以及下游分子syncytin1和syncytin2的mRNA表達水平的影響。在293T細胞中共同轉(zhuǎn)染表達Twist1的質(zhì)粒及插入GCM1基因第二內(nèi)含子區(qū)域的報告質(zhì)粒,利用熒光素酶報告實驗檢測了不同總量的Twist1質(zhì)粒對GCM1轉(zhuǎn)錄活性的影響。進一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗研究Twist1蛋白與GCM1靶基因的相互作用。[研究結(jié)果](1)免疫組化結(jié)果顯示Twist1和GCM1在人類妊娠早期絨毛中具有相似的表達定位,在妊娠早期絨毛的細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層都有表達,具有明顯的核定位信號。(2)與常氧(20%)培養(yǎng)條件相比,從足月胎盤分離得到的原代滋養(yǎng)層細胞在低氧(2%)條件中培養(yǎng)時,融合能力受到影響,表現(xiàn)為β-hCG蛋白的表達水平受到抑制。在常氧(20%)培養(yǎng)條件下,隨著培養(yǎng)時間的延長,原代滋養(yǎng)層細胞的Twist1蛋白表達水平升高及GCM1的mRNA水平顯著升高。而在低氧(2%)培養(yǎng)條件下,Twist1蛋白的表達水平及GCM1的mRNA水平同時受到抑制。(3)在人絨毛膜癌來源的細胞系BeWo細胞中特異性地敲低Twist1的表達,GCM1在siRNA實驗組的mRNA水平顯著降低。GCM1下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA實驗組亦顯著降低。(4)在293T細胞中共轉(zhuǎn)染了過表達Twist1質(zhì)粒和GCM1報告質(zhì)粒,熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)Twist1影響了GCM1的轉(zhuǎn)錄活性,具有增強GCM1轉(zhuǎn)錄活性的作用,并且隨著轉(zhuǎn)染過表達Twist1質(zhì)�？偭康脑黾�,GCM1的轉(zhuǎn)錄活性也隨著升高。(5)BeWo細胞中加入FSK誘導融合48小時后,通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Twist1可以與位于GCM1基因第二內(nèi)含子中的E-box序列結(jié)合。[研究結(jié)論](1)Twist1和GCM1在妊娠早期絨毛中相似的表達定位,并且在不同氧氣濃度培養(yǎng)條件下,Twist1和GCM1表達水平的變化趨勢具有相似性,推測Twist1和GCM1之間是否存在可能的聯(lián)系。(2)在BeWo細胞中特異性敲低Twist1的表達后,GCM1及其下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA實驗組顯著降低,提示Twist1可能通過調(diào)控GCM 1的表達促進滋養(yǎng)層細胞的融合。(3)為了進一步驗證了以上假設(shè),通過熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)Twist1可增強GCM1的轉(zhuǎn)錄活性。同時,染色質(zhì)免疫共沉淀研究結(jié)果顯示Twist1可與GCM1基因的第2內(nèi)含子中富含E-box序列的區(qū)域結(jié)合。綜上所述,Twist1可能通過與GCM1基因第2內(nèi)含子中的E-box序列結(jié)合,從而調(diào)控GCM1的表達,促進滋養(yǎng)層細胞的融合。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321

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本文編號：1872247