發(fā)布時間：2018-05-02 11:23

  本文選題：金黃色葡萄球菌 + MntC　； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)引起人類多種感染性疾病,如菌血癥、肺炎、心內膜炎、骨髓炎、膿毒癥等,具有較高的發(fā)病率和死亡率,嚴重威脅著人類的生命健康。近年來,隨著金葡菌耐藥性問題的日趨嚴重,抗生素在臨床治療中已經(jīng)無法達到完全控制金葡菌感染的要求,迫切需要研制安全有效的金葡菌疫苗。如何篩選獲得高效的免疫保護性抗原是金葡菌疫苗研制的關鍵,我們前期研究發(fā)現(xiàn)金葡菌錳離子轉運蛋白C(Manganese ion transport protein C,MntC)具有良好的免疫保護效果。MntC是金葡菌全身感染的重要毒力因子,使用MntC基因敲除菌株感染小鼠可以明顯延長小鼠的生存率;抗MntC的單克隆抗體在金葡菌感染的小鼠中誘導出較強的中性粒細胞吞噬活性,在小鼠的被動免疫保護模型中產(chǎn)生免疫保護作用,這些研究都為MntC作為金葡菌疫苗的有效保護性抗原提供了理論參考。疫苗抗原激發(fā)機體免疫應答主要依托于保護性免疫優(yōu)勢表位,抗原表位是指蛋白抗原中能夠有效刺激機體產(chǎn)生免疫應答的一段序列,通常由8-20個氨基酸構成。因此,篩選并鑒定金葡菌MntC蛋白的免疫優(yōu)勢表位,將有助于揭示MntC抗原的免疫保護機制和優(yōu)化金葡菌疫苗的設計策略。目前未見關于MntC免疫優(yōu)勢表位的相關研究報道。本研究擬運用基因工程技術克隆表達MntC抗原蛋白,將高度純化的MntC抗原與不同免疫佐劑配制成MntC亞單位疫苗,經(jīng)金葡菌感染動物模型免疫攻毒保護試驗,確定其免疫保護性。同時,合成重疊18肽,采用氨基酸步移技術,高通量篩選MntC抗原優(yōu)勢保護性B細胞表位,將獲得的優(yōu)勢表位與蛋白鑰孔戚血藍素(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶聯(lián),制備成表位多肽疫苗,評價其免疫保護效果,鑒定MntC免疫保護性優(yōu)勢抗原B細胞表位功能,探討優(yōu)勢抗原B細胞表位免疫應答機制,為金葡菌疫苗抗原組分篩選提供免疫學依據(jù)。研究方法:第一部分:金葡菌MntC基因工程疫苗菌株構建及其免疫保護功能研究1.為制備重組MntC蛋白,運用生物信息學方法檢索金葡菌MntC蛋白的基因序列及氨基酸信息,利用基因工程技術構建含有MntC全長蛋白的原核表達質粒,通過p GEX-6p-2載體系統(tǒng)在大腸桿菌BL21中表達重組MntC蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定蛋白的分子量和純度。使用MMC離子交換層析法純化蛋白,使其純度大于95%,通過Q-HP填料去除內毒素,用BCA法檢測純化后蛋白濃度。2.為評價MntC疫苗對金葡菌感染的免疫保護效果,分別使用弗氏佐劑(CFA/IFA)和鋁(Alum)佐劑制備MntC蛋白疫苗,于0、14、21天免疫BALB/c小鼠,末次免疫后14天,選用金葡菌國際標準株MRSA252攻毒,統(tǒng)計攻毒后14天內不同實驗組小鼠的生存數(shù)量,并按照以下公式計算疫苗免疫保護率:疫苗免疫保護率%=(疫苗試驗組小鼠生存率%-佐劑對照組生存率%)/疫苗試驗組小鼠生存率%。3.為評價MntC疫苗對不同地區(qū)及標本來源金葡菌菌株感染的免疫保護效果,選取金葡菌國際標準株WHO2及3株分別來自我國北京、廣州、重慶地區(qū)臨床分離株進行攻毒,統(tǒng)計攻毒后14天內不同實驗組小鼠的生存數(shù)量,并按照以下公式計算疫苗免疫保護率:疫苗免疫保護率%=(對照組感染率-試驗疫苗組感染率)/對照組感染率×100%。4.為評價疫苗免疫后小鼠的體液和細胞免疫應答水平,分別收集疫苗免疫后的小鼠血清,用ELISA法檢測小鼠Ig G、Ig G1和Ig G2a的抗體表達水平;手術摘取疫苗免疫后的小鼠脾臟,制備脾細胞懸液,與MntC抗原共培養(yǎng),收集脾細胞培養(yǎng)上清,檢測脾細胞分泌的IFN-γ、IL-5、IL-17A水平。第二部分:金葡菌MntC蛋白B細胞優(yōu)勢表位鑒定及表位疫苗的免疫保護功能研究1.免后陽性血清制備:采用弗氏佐劑(CFA/IFA)制備MntC疫苗,于0、14、21天免疫接種10只BALB/c小鼠,末次免疫后7天采集分離血清,標記對應小鼠序號后,-80℃保存,備用于優(yōu)勢表位鑒定試驗;免后感染陽性血清制備:采用弗氏佐劑(CFA/IFA)制備MntC疫苗,于0、14、21天免疫接種10只BALB/c小鼠,末次免疫后14天的小鼠經(jīng)亞致死劑量(8.4×108CFU)金葡菌株MRSA252攻毒,感染后3天采集分離血清,標記對應小鼠序號后,-80℃保存,備用于優(yōu)勢表位鑒定試驗;陰性對照血清制備:采集10只正常BALB/c小鼠血清,標記對應小鼠序號后,-80℃保存,備用于優(yōu)勢表位鑒定試驗;2.為系統(tǒng)分析金葡菌MntC抗原的線性B細胞免疫優(yōu)勢表位肽,合成覆蓋MntC全長的46條重疊18肽,以無關肽段GST和無關蛋白BSA作為陰性對照,以MntC蛋白作為陽性對照,分別作為捕獲抗原包被于ELISA反應板孔,然后分別加入上述3種血清,根據(jù)各肽段與抗血清反應結合的能力,鑒定出MntC抗原的優(yōu)勢免疫表位。3.為明確優(yōu)勢表位在多種金葡菌株中的序列保守性,通過Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫對17種不同來源金葡菌株中MntC的氨基酸序列進行同源性比對。同時用Py MOL1.1軟件定位鑒定優(yōu)勢表位在全蛋白結構中的位置。4.為評價MntC優(yōu)勢表位肽免疫保護能力,分別將篩選到的優(yōu)勢表位肽與KLH偶聯(lián),再與等體積CFA/IFA進行乳化混合,制備成多個多肽表位疫苗。同時將制備好的多個表位疫苗以物理方式混合,制成多表位聯(lián)合疫苗。以MntC全蛋白為陽性對照、以KLH蛋白作為陰性對照,0、14、21天免疫BALB/c小鼠,末次免疫后的14天進行MRSA252菌株的致死劑量攻毒,分析感染后14天內小鼠生存率和免疫保護率。5.收集分離單一表位疫苗及多表位聯(lián)合疫苗免疫后小鼠血清,使用ELISA法檢測抗血清的Ig G抗體及其亞型Ig G1、Ig G2a、Ig G2b的水平。6.參考《中國藥典》(2015年版)進行抗體介導的體外調理吞噬試驗,計算各試驗組抗血清殺菌率。研究結果:第一部分:金葡菌MntC基因工程疫苗菌株構建及其免疫保護功能研究結果1.成功制備出重組MntC蛋白;經(jīng)鑒定,MntC蛋白的分子量在33KD左右;經(jīng)多步純化MntC純度為98%,符合后期疫苗抗原的質量要求;BCA法檢測蛋白濃度為1.6 mg/m L。2.組氨酸緩沖液對照組、弗氏佐劑對照組、鋁佐劑對照組、MntC弗氏佐劑疫苗試驗組及MntC鋁佐劑疫苗試驗組的生存率分別為0%(0/0)、0%(0/9)、0%(0/9)、56%(5/9)、44%(4/9)。MntC弗氏佐劑疫苗試驗組及MntC鋁佐劑疫苗試驗組的免疫保護率分別為56%、44%。結果表明:當佐劑與MntC形成疫苗時,可產(chǎn)生良好的免疫保護效果。由此提示,MntC具有良好的免疫原性。3.4種不同來源金葡菌株攻毒后疫苗試驗組的保護率分別為25%、38%、50%和56%,各試驗組保護率結果與對照組相比較具有顯著性統(tǒng)計學差異(P0.05),但是,不同攻毒菌株試驗組之間保護率結果具有不同差異。由此提示,MntC鋁佐劑疫苗對不同來源的金葡菌株具有廣泛的免疫保護性。4.MntC弗氏佐劑疫苗組激發(fā)的的Ig G和Ig G1抗體水平顯著高于MntC鋁佐劑疫苗組抗體水平(P0.01);Ig G2a抗體水平在兩種佐劑疫苗組之間無顯著性統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.疫苗免疫后,各組小鼠脾細胞分泌IL-5的表達水平無顯著性統(tǒng)計學差異(P0.05),但是MntC弗氏佐劑疫苗組小鼠脾細胞分泌的IFN-γ和IL-17A的水平顯著高于MntC鋁佐劑疫苗組細胞因子水平(P0.01)。第二部分:金葡菌MntC蛋白B細胞優(yōu)勢表位鑒定及表位疫苗的免疫保護功能研究結果1.氨基酸步移法的ELISA檢測結果發(fā)現(xiàn),在MntC全長309個氨基酸中,有3個B細胞免疫優(yōu)勢抗原表位,分別為:MntC113 136、MntC209 232和MntC263 286。2.所鑒定出的MntC113 136、MntC209 232和MntC263 286三個優(yōu)勢表位肽在免疫后血清中的Ig G抗體效價為1:1200,在免疫后感染血清中的Ig G抗體效價為1:600,而其它非優(yōu)勢表位肽的抗體應答水平均低于1:100,兩者比較,具有顯著性統(tǒng)計學差異(P0.01)。3.同源性分析顯示,3個優(yōu)勢表位的氨基酸序列在17株來源不同金葡菌株中的一致性為100%,具有高度保守性。定位于MntC三維晶體結構中抗原表面,且均為顯性免疫原性刺激區(qū)。4.在弗氏佐劑輔助下,免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗及MntC疫苗的免疫保護率分別為78%和67%,顯著高于單獨表位疫苗組和佐劑及緩沖液對照組(P0.01)。5.免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗組和MntC全蛋白疫苗組均激發(fā)了較高的Ig G、Ig G1和Ig G2b抗體水平,呈現(xiàn)Th2偏向的體液免疫應答,其血清總抗體Ig G表達效價可高達1:1024000;相對于表位疫苗組,MntC全蛋白疫苗組更傾向于引起Th1細胞免疫應答的Ig G2a抗體高表達。6.免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗及MntC疫苗抗血清,在體外對MRSA252殺傷率均可達到85%以上,并且經(jīng)過1:3的稀釋后,該抗血清體外調理吞噬金葡菌的能力仍可維持在50%以上,顯著高于單表位疫苗組和佐劑、緩沖液對照組(P0.01)。研究結論:通過基因工程技術制備了MntC亞單位疫苗,經(jīng)過小鼠金葡菌全身感染致死模型免疫攻毒保護試驗,表明MntC疫苗對于不同來源的金葡菌株具有良好的免疫保護效果,MntC有望成為金葡菌疫苗的候選抗原組分。免疫應答檢測結果顯示體液免疫發(fā)揮了主導作用。通過合成46條18-肽,運用氨基酸步移法首次鑒定發(fā)現(xiàn)了MntC中3個免疫優(yōu)勢抗原表位,分別是MntC113 136、MntC209 232和MntC263 286。這些表位在不同的金葡菌株中都具有高度保守性,定位于MntC蛋白三維晶體結構的表面,處于顯性免疫原性刺激區(qū)。分別將3個優(yōu)勢多肽表位與KLH偶聯(lián),制備成免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗,激發(fā)了較高的Ig G、Ig G1和Ig G2b抗體水平,呈現(xiàn)Th2偏向的體液免疫應答,血清總Ig G表達效價達1:1024000,免疫保護率為78%,顯著高于單獨表位疫苗組(P0.01);特異性抗體具有高效體外調理吞噬殺傷金葡菌的功能。闡明了MntC抗原免疫保護應答新機制,為金葡菌疫苗的研制提供了新的實驗證據(jù)與新思路。
[Abstract]:In recent years , it has been found that MntC is an important virulence factor in the development of Staphylococcus aureus vaccine . It is necessary to study the immune protective effect of MntC . The recombinant MntC protein was expressed in E . coli BL21 by a p - type - 6p - 2 carrier system . The molecular weight and purity of the protein were determined by SDS - PAGE . Ig G2a鎶椾綋姘村鉤鍦ㄤ袱縐嶄綈鍓傜柅鑻楃粍涔嬮棿鏃犳樉钁楁，

本文編號：1833666