本文選題：金黃色葡萄球菌 + MntC��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)引起人類多種感染性疾病,如菌血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、膿毒癥等,具有較高的發(fā)病率和死亡率,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。近年來,隨著金葡菌耐藥性問題的日趨嚴(yán)重,抗生素在臨床治療中已經(jīng)無法達(dá)到完全控制金葡菌感染的要求,迫切需要研制安全有效的金葡菌疫苗。如何篩選獲得高效的免疫保護(hù)性抗原是金葡菌疫苗研制的關(guān)鍵,我們前期研究發(fā)現(xiàn)金葡菌錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C(Manganese ion transport protein C,MntC)具有良好的免疫保護(hù)效果。MntC是金葡菌全身感染的重要毒力因子,使用MntC基因敲除菌株感染小鼠可以明顯延長小鼠的生存率;抗MntC的單克隆抗體在金葡菌感染的小鼠中誘導(dǎo)出較強(qiáng)的中性粒細(xì)胞吞噬活性,在小鼠的被動免疫保護(hù)模型中產(chǎn)生免疫保護(hù)作用,這些研究都為MntC作為金葡菌疫苗的有效保護(hù)性抗原提供了理論參考。疫苗抗原激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答主要依托于保護(hù)性免疫優(yōu)勢表位,抗原表位是指蛋白抗原中能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的一段序列,通常由8-20個(gè)氨基酸構(gòu)成。因此,篩選并鑒定金葡菌MntC蛋白的免疫優(yōu)勢表位,將有助于揭示MntC抗原的免疫保護(hù)機(jī)制和優(yōu)化金葡菌疫苗的設(shè)計(jì)策略。目前未見關(guān)于MntC免疫優(yōu)勢表位的相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬運(yùn)用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)MntC抗原蛋白,將高度純化的MntC抗原與不同免疫佐劑配制成MntC亞單位疫苗,經(jīng)金葡菌感染動物模型免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn),確定其免疫保護(hù)性。同時(shí),合成重疊18肽,采用氨基酸步移技術(shù),高通量篩選MntC抗原優(yōu)勢保護(hù)性B細(xì)胞表位,將獲得的優(yōu)勢表位與蛋白鑰孔戚血藍(lán)素(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶聯(lián),制備成表位多肽疫苗,評價(jià)其免疫保護(hù)效果,鑒定MntC免疫保護(hù)性優(yōu)勢抗原B細(xì)胞表位功能,探討優(yōu)勢抗原B細(xì)胞表位免疫應(yīng)答機(jī)制,為金葡菌疫苗抗原組分篩選提供免疫學(xué)依據(jù)。研究方法:第一部分:金葡菌MntC基因工程疫苗菌株構(gòu)建及其免疫保護(hù)功能研究1.為制備重組MntC蛋白,運(yùn)用生物信息學(xué)方法檢索金葡菌MntC蛋白的基因序列及氨基酸信息,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建含有MntC全長蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒,通過p GEX-6p-2載體系統(tǒng)在大腸桿菌BL21中表達(dá)重組MntC蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定蛋白的分子量和純度。使用MMC離子交換層析法純化蛋白,使其純度大于95%,通過Q-HP填料去除內(nèi)毒素,用BCA法檢測純化后蛋白濃度。2.為評價(jià)MntC疫苗對金葡菌感染的免疫保護(hù)效果,分別使用弗氏佐劑(CFA/IFA)和鋁(Alum)佐劑制備MntC蛋白疫苗,于0、14、21天免疫BALB/c小鼠,末次免疫后14天,選用金葡菌國際標(biāo)準(zhǔn)株MRSA252攻毒,統(tǒng)計(jì)攻毒后14天內(nèi)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存數(shù)量,并按照以下公式計(jì)算疫苗免疫保護(hù)率:疫苗免疫保護(hù)率%=(疫苗試驗(yàn)組小鼠生存率%-佐劑對照組生存率%)/疫苗試驗(yàn)組小鼠生存率%。3.為評價(jià)MntC疫苗對不同地區(qū)及標(biāo)本來源金葡菌菌株感染的免疫保護(hù)效果,選取金葡菌國際標(biāo)準(zhǔn)株WHO2及3株分別來自我國北京、廣州、重慶地區(qū)臨床分離株進(jìn)行攻毒,統(tǒng)計(jì)攻毒后14天內(nèi)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存數(shù)量,并按照以下公式計(jì)算疫苗免疫保護(hù)率:疫苗免疫保護(hù)率%=(對照組感染率-試驗(yàn)疫苗組感染率)/對照組感染率×100%。4.為評價(jià)疫苗免疫后小鼠的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,分別收集疫苗免疫后的小鼠血清,用ELISA法檢測小鼠Ig G、Ig G1和Ig G2a的抗體表達(dá)水平;手術(shù)摘取疫苗免疫后的小鼠脾臟,制備脾細(xì)胞懸液,與MntC抗原共培養(yǎng),收集脾細(xì)胞培養(yǎng)上清,檢測脾細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-5、IL-17A水平。第二部分:金葡菌MntC蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢表位鑒定及表位疫苗的免疫保護(hù)功能研究1.免后陽性血清制備:采用弗氏佐劑(CFA/IFA)制備MntC疫苗,于0、14、21天免疫接種10只BALB/c小鼠,末次免疫后7天采集分離血清,標(biāo)記對應(yīng)小鼠序號后,-80℃保存,備用于優(yōu)勢表位鑒定試驗(yàn);免后感染陽性血清制備:采用弗氏佐劑(CFA/IFA)制備MntC疫苗,于0、14、21天免疫接種10只BALB/c小鼠,末次免疫后14天的小鼠經(jīng)亞致死劑量(8.4×108CFU)金葡菌株MRSA252攻毒,感染后3天采集分離血清,標(biāo)記對應(yīng)小鼠序號后,-80℃保存,備用于優(yōu)勢表位鑒定試驗(yàn);陰性對照血清制備:采集10只正常BALB/c小鼠血清,標(biāo)記對應(yīng)小鼠序號后,-80℃保存,備用于優(yōu)勢表位鑒定試驗(yàn);2.為系統(tǒng)分析金葡菌MntC抗原的線性B細(xì)胞免疫優(yōu)勢表位肽,合成覆蓋MntC全長的46條重疊18肽,以無關(guān)肽段GST和無關(guān)蛋白BSA作為陰性對照,以MntC蛋白作為陽性對照,分別作為捕獲抗原包被于ELISA反應(yīng)板孔,然后分別加入上述3種血清,根據(jù)各肽段與抗血清反應(yīng)結(jié)合的能力,鑒定出MntC抗原的優(yōu)勢免疫表位。3.為明確優(yōu)勢表位在多種金葡菌株中的序列保守性,通過Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫對17種不同來源金葡菌株中MntC的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對。同時(shí)用Py MOL1.1軟件定位鑒定優(yōu)勢表位在全蛋白結(jié)構(gòu)中的位置。4.為評價(jià)MntC優(yōu)勢表位肽免疫保護(hù)能力,分別將篩選到的優(yōu)勢表位肽與KLH偶聯(lián),再與等體積CFA/IFA進(jìn)行乳化混合,制備成多個(gè)多肽表位疫苗。同時(shí)將制備好的多個(gè)表位疫苗以物理方式混合,制成多表位聯(lián)合疫苗。以MntC全蛋白為陽性對照、以KLH蛋白作為陰性對照,0、14、21天免疫BALB/c小鼠,末次免疫后的14天進(jìn)行MRSA252菌株的致死劑量攻毒,分析感染后14天內(nèi)小鼠生存率和免疫保護(hù)率。5.收集分離單一表位疫苗及多表位聯(lián)合疫苗免疫后小鼠血清,使用ELISA法檢測抗血清的Ig G抗體及其亞型Ig G1、Ig G2a、Ig G2b的水平。6.參考《中國藥典》(2015年版)進(jìn)行抗體介導(dǎo)的體外調(diào)理吞噬試驗(yàn),計(jì)算各試驗(yàn)組抗血清殺菌率。研究結(jié)果:第一部分:金葡菌MntC基因工程疫苗菌株構(gòu)建及其免疫保護(hù)功能研究結(jié)果1.成功制備出重組MntC蛋白;經(jīng)鑒定,MntC蛋白的分子量在33KD左右;經(jīng)多步純化MntC純度為98%,符合后期疫苗抗原的質(zhì)量要求;BCA法檢測蛋白濃度為1.6 mg/m L。2.組氨酸緩沖液對照組、弗氏佐劑對照組、鋁佐劑對照組、MntC弗氏佐劑疫苗試驗(yàn)組及MntC鋁佐劑疫苗試驗(yàn)組的生存率分別為0%(0/0)、0%(0/9)、0%(0/9)、56%(5/9)、44%(4/9)。MntC弗氏佐劑疫苗試驗(yàn)組及MntC鋁佐劑疫苗試驗(yàn)組的免疫保護(hù)率分別為56%、44%。結(jié)果表明:當(dāng)佐劑與MntC形成疫苗時(shí),可產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果。由此提示,MntC具有良好的免疫原性。3.4種不同來源金葡菌株攻毒后疫苗試驗(yàn)組的保護(hù)率分別為25%、38%、50%和56%,各試驗(yàn)組保護(hù)率結(jié)果與對照組相比較具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但是,不同攻毒菌株試驗(yàn)組之間保護(hù)率結(jié)果具有不同差異。由此提示,MntC鋁佐劑疫苗對不同來源的金葡菌株具有廣泛的免疫保護(hù)性。4.MntC弗氏佐劑疫苗組激發(fā)的的Ig G和Ig G1抗體水平顯著高于MntC鋁佐劑疫苗組抗體水平(P0.01);Ig G2a抗體水平在兩種佐劑疫苗組之間無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5.疫苗免疫后,各組小鼠脾細(xì)胞分泌IL-5的表達(dá)水平無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但是MntC弗氏佐劑疫苗組小鼠脾細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-17A的水平顯著高于MntC鋁佐劑疫苗組細(xì)胞因子水平(P0.01)。第二部分:金葡菌MntC蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢表位鑒定及表位疫苗的免疫保護(hù)功能研究結(jié)果1.氨基酸步移法的ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在MntC全長309個(gè)氨基酸中,有3個(gè)B細(xì)胞免疫優(yōu)勢抗原表位,分別為:MntC113 136、MntC209 232和MntC263 286。2.所鑒定出的MntC113 136、MntC209 232和MntC263 286三個(gè)優(yōu)勢表位肽在免疫后血清中的Ig G抗體效價(jià)為1:1200,在免疫后感染血清中的Ig G抗體效價(jià)為1:600,而其它非優(yōu)勢表位肽的抗體應(yīng)答水平均低于1:100,兩者比較,具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。3.同源性分析顯示,3個(gè)優(yōu)勢表位的氨基酸序列在17株來源不同金葡菌株中的一致性為100%,具有高度保守性。定位于MntC三維晶體結(jié)構(gòu)中抗原表面,且均為顯性免疫原性刺激區(qū)。4.在弗氏佐劑輔助下,免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗及MntC疫苗的免疫保護(hù)率分別為78%和67%,顯著高于單獨(dú)表位疫苗組和佐劑及緩沖液對照組(P0.01)。5.免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗組和MntC全蛋白疫苗組均激發(fā)了較高的Ig G、Ig G1和Ig G2b抗體水平,呈現(xiàn)Th2偏向的體液免疫應(yīng)答,其血清總抗體Ig G表達(dá)效價(jià)可高達(dá)1:1024000;相對于表位疫苗組,MntC全蛋白疫苗組更傾向于引起Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的Ig G2a抗體高表達(dá)。6.免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗及MntC疫苗抗血清,在體外對MRSA252殺傷率均可達(dá)到85%以上,并且經(jīng)過1:3的稀釋后,該抗血清體外調(diào)理吞噬金葡菌的能力仍可維持在50%以上,顯著高于單表位疫苗組和佐劑、緩沖液對照組(P0.01)。研究結(jié)論:通過基因工程技術(shù)制備了MntC亞單位疫苗,經(jīng)過小鼠金葡菌全身感染致死模型免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn),表明MntC疫苗對于不同來源的金葡菌株具有良好的免疫保護(hù)效果,MntC有望成為金葡菌疫苗的候選抗原組分。免疫應(yīng)答檢測結(jié)果顯示體液免疫發(fā)揮了主導(dǎo)作用。通過合成46條18-肽,運(yùn)用氨基酸步移法首次鑒定發(fā)現(xiàn)了MntC中3個(gè)免疫優(yōu)勢抗原表位,分別是MntC113 136、MntC209 232和MntC263 286。這些表位在不同的金葡菌株中都具有高度保守性,定位于MntC蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)的表面,處于顯性免疫原性刺激區(qū)。分別將3個(gè)優(yōu)勢多肽表位與KLH偶聯(lián),制備成免疫優(yōu)勢表位多肽聯(lián)合疫苗,激發(fā)了較高的Ig G、Ig G1和Ig G2b抗體水平,呈現(xiàn)Th2偏向的體液免疫應(yīng)答,血清總Ig G表達(dá)效價(jià)達(dá)1:1024000,免疫保護(hù)率為78%,顯著高于單獨(dú)表位疫苗組(P0.01);特異性抗體具有高效體外調(diào)理吞噬殺傷金葡菌的功能。闡明了MntC抗原免疫保護(hù)應(yīng)答新機(jī)制,為金葡菌疫苗的研制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)與新思路。
[Abstract]:In recent years , it has been found that MntC is an important virulence factor in the development of Staphylococcus aureus vaccine . It is necessary to study the immune protective effect of MntC . The recombinant MntC protein was expressed in E . coli BL21 by a p - type - 6p - 2 carrier system . The molecular weight and purity of the protein were determined by SDS - PAGE . Ig G2a鎶椾綋姘村鉤鍦ㄤ袱縐嶄綈鍓傜柅鑻楃粍涔嬮棿鏃犳樉钁楁，

本文編號：1833666