發(fā)布時(shí)間：2018-04-24 08:28

  本文選題：日本血吸蟲 + 生殖發(fā)育��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:Vasa基因首次在果蠅中發(fā)現(xiàn),是胚胎形成和生殖細(xì)胞發(fā)育過程中所必需的因子。在斑馬魚中,Vasa基因作為一個(gè)母源性基因產(chǎn)物,主要存儲(chǔ)于卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中,是生殖細(xì)胞形成的關(guān)鍵因素。由于Vasa基因與大多數(shù)物種生殖器官的生長發(fā)育密切相關(guān),因此我們推測(cè)日本血吸蟲Vasa基因編碼的蛋白在其生殖器官的發(fā)育中也起一定的作用。方法:經(jīng)過整蟲原位雜交的方法對(duì)Vasa3基因在日本血吸蟲18天、24天、36天和42天不同發(fā)育階段成蟲進(jìn)行基因定位;再通過RNAi的方法鑒定SjVasa3基因的功能。以SjVasa3為靶序列,根據(jù)siRNA篩選原則通過軟件設(shè)計(jì)出3個(gè)不同靶區(qū)域的SjVasa3 siRNAl,SjVasa3 siRNA2和SjVasa3siRNA3,經(jīng)過熒光定量PCR確定有效siRNA,再利用該siRNA分別3次體外轉(zhuǎn)染28天的日本血吸蟲成蟲。RNA干擾10天后首先通過熒光定量PCR和Western Blot方法確定其基因和蛋白水平消減效果,再通過激光共聚焦顯微鏡觀察雌蟲的卵巢、卵黃腺,雄蟲的睪丸、貯精囊內(nèi)的精子和子宮內(nèi)蟲卵的數(shù)量。另外,分別在RNA干擾的第4、第7和第10天通過光學(xué)顯微鏡下觀察蟲體合抱情況、蟲卵形態(tài)和數(shù)量的變化。結(jié)果:本研究課題前期通過整蟲原位雜交的方法對(duì)不同發(fā)育階段的日本血吸蟲成蟲進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)在18天感染的日本血吸蟲的睪丸和卵巢沒有明顯的陽性信號(hào)。但是在24天、36天和42天感染的日本血吸蟲,SjVasa3在雌蟲卵巢的后端有所表達(dá),而在雄蟲的睪丸中沒有出現(xiàn)明顯的陽性信號(hào)。熒光定量PCR結(jié)果顯示得出有效靶序列為SjVasa3siRNAl。該siRNA體外轉(zhuǎn)染3次的蟲體培養(yǎng)10天后,與錯(cuò)亂siRNA處理組相比,SjVasa3在轉(zhuǎn)錄水平下降了 80%,蛋白水平下降了 60%。激光共聚焦掃描顯微鏡的觀察結(jié)果顯示,消減了SjVasa3基因,在日本血吸蟲雄蟲的睪丸萎縮、貯精囊內(nèi)的精子變少變圓;雌蟲卵巢內(nèi)成熟卵母細(xì)胞和不成熟卵母細(xì)胞比例分布失調(diào),卵黃腺內(nèi)的卵黃細(xì)胞排列順序發(fā)生紊亂;子宮內(nèi)蟲卵的數(shù)量明顯減少。在SjVasa3基因消減后,通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù),與錯(cuò)亂siRNA處理組相比,發(fā)現(xiàn)在第4天和第7天雌蟲的產(chǎn)卵數(shù)量和子宮內(nèi)蟲卵的數(shù)量變化都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在第10天時(shí)雌蟲的產(chǎn)卵數(shù)量下降約60%和子宮內(nèi)蟲卵的數(shù)量下降約68% (p0.05)。同時(shí)蟲體的合抱率在第7天和第10天時(shí)分別下降了約30%和47% (p0.05),在第4天蟲體的合抱率不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:通過RNAi技術(shù),體外驗(yàn)證消減日本血吸蟲Vasa3基因的表達(dá),血吸蟲雌蟲卵巢、卵黃腺和雄蟲睪丸形態(tài)發(fā)生明顯的變化,并且雌蟲的產(chǎn)卵量也受到顯著的影響,證明了日本血吸蟲Vasa3基因在其生殖系統(tǒng)器官發(fā)育和蟲卵形成中具有重要的功能。
[Abstract]:Objective to identify for the first time in Drosophila the Vasa gene as an essential factor in embryogenesis and germ cell development. As a mother gene product, Vasa gene is mainly stored in the cytoplasm of oocytes and is the key factor of germ cell formation in zebrafish. Because the Vasa gene is closely related to the growth and development of reproductive organs in most species, we speculate that the protein encoded by Vasa gene of Schistosoma japonicum also plays a role in the development of reproductive organs of Schistosoma japonicum. Methods: by in situ hybridization, the Vasa3 gene was located in 18 days, 24 days, 36 days and 42 days, and the function of SjVasa3 gene was identified by RNAi. Using SjVasa3 as the target sequence, According to siRNA screening principle, three different target regions of SjVasa3 siRNAlSjVasa3 siRNA2 and SjVasa3 siRNA3 were designed by software. The effective siRNAs were determined by fluorescent quantitative PCR. The siRNAs were transfected into Schistosoma japonicum adult for 28 days in vitro three times with the siRNA for 10 days. Fluorescence quantitative PCR and Western Blot were used to determine the subtractive effect of the gene and protein levels. The number of ovaries, yolk glands, testis of males, seminal vesicles and the number of eggs in uterus were observed by confocal laser microscopy. In addition, on the 4th, 7th and 10th day of RNA interference, the morphology and number of eggs were observed under optical microscope. Results: in the early stage of this study, the adult Schistosoma japonicum in different developmental stages was located by in situ hybridization. It was found that there were no obvious positive signals in testis and ovaries of Schistosoma japonicum infected at 18 days. However, Sj Vasa3 of Schistosoma japonicum infected at day 24 and day 42 was expressed at the posterior end of the female ovary, but there was no obvious positive signal in the testis of the male worm. Fluorescence quantitative PCR showed that the effective target sequence was SjVasa3siRNAl. After 10 days of culture of the siRNA transfected for three times in vitro, Sj Vasa3 decreased by 80% at the transcription level and the protein level decreased by 60% compared with that of the siRNA treatment group. The results of confocal laser scanning microscopy showed that the SjVasa3 gene was subtracted, the testis of Schistosoma japonicum shrank, the spermatozoa in the seminal vesicle became less round, and the proportion of mature oocytes and immature oocytes in the ovaries of female worms was misdistributed. The order of egg yolk cells in yolk gland was disordered, and the number of eggs in uterus decreased obviously. After subtractive of SjVasa3 gene, the egg counts were counted by optical microscope. The results showed that there was no significant difference in the number of eggs laid by females and the number of eggs in uterus on the 4th and 7th day after treatment with siRNA. On the 10th day, the number of eggs laid by females decreased by about 60%, and the number of eggs in uterus decreased by about 68% (p0.05). At the same time, the rate of cuddling decreased by about 30% and 47% respectively on the 7th and 10th day, but there was no significant difference on the 4th day. Conclusion: the expression of Vasa3 gene of Schistosoma japonicum was subtracted by RNAi technique in vitro. The morphology of female ovaries, yolk glands and testis of males were significantly changed, and the number of eggs laid by females was also significantly affected. It is proved that the Vasa3 gene of Schistosoma japonicum plays an important role in the development of reproductive organs and egg formation of Schistosoma japonicum.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R383.24

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本文編號(hào)：1795894