發(fā)布時間：2018-04-19 06:02

  本文選題：白紋伊蚊 + 34K2蛋白�。� 參考：《貴州醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:獲取純化的白紋伊蚊(廣州株)唾液34K2重組蛋白,體外探討其在DENV2感染人角質(zhì)形成細胞(Haca T)中可能的生物學(xué)功能。方法:IPTG誘導(dǎo)p ET-28-34K2/BL21(DE3)重組菌,12%SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達形式和分子量大小,鎳柱親和層析法純化34K2重組蛋白(r Ab-34K2),免疫印跡(Western blotting)法對重組蛋白的特異性進行鑒定;實時無標記細胞動態(tài)分析法(RTCA)監(jiān)測r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)對Haca T細胞生長的影響及對DENV2(MOI=1)感染Haca T細胞引發(fā)細胞病變(CPE)效應(yīng)的影響;q RT-PCR實時檢測r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)對DENV2(MOI=1/0.1)感染Haca T細胞后病毒核酸、IFN-α/β、IL-1β、TNF-α、及IL-10的m RNA的變化;流式細胞術(shù)(FACS)檢測r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)在DENV2(MOI=1)感染前后Haca T細胞凋亡的影響。結(jié)果:r Ab-34K2重組蛋白以包涵體形式表達,經(jīng)尿素變復(fù)性后,親和層析法可獲得純化的r Ab-34K2蛋白,蛋白濃度為350μg/m L;RTCA結(jié)果顯示r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)對人角質(zhì)形成細胞(Haca T)的生長無明顯影響;在DENV2(MOI=1)時,含10μg/m L r Ab-34K2蛋白組細胞指數(shù)(CI)峰值較病毒對照組降低1.3798倍(P0.05),CIT50(到達50%CI值時間)較對照組縮短5.9小時(P0.05);胞內(nèi)DENV2 NS1核酸片段檢測顯示:MOI=1時,感染12h各組胞內(nèi)病毒核酸表達較高,隨后逐漸降低,感染36h時r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)組顯著高于單純DENV2感染組(其中1μg/m L組高于對照組2.6509倍,P0.05;10μg/m L組高于對照組3.5527倍,P0.01);在MOI=0.1時,感染48h、60h、70h后r Ab-34K2蛋白組胞內(nèi)病毒核酸水平均較病毒對照組顯著增高(其中48h時1μg/m L組高于對照組2.3333倍,P0.001,10μg/m L組高于對照組3.625倍,P0.001;60h時1μg/m L組高于對照組2.7778倍,P0.001,10μg/m L組高于對照組4倍,P0.001;70h時1μg/m L組高于對照組2.8846倍,P0.001,10μg/m L組高于對照組4.1538倍,P0.001);檢測MOI=1感染模型中細胞因子的情況為:感染24h r Ab-34K2蛋白組IFN-α/β細胞因子的相對表達量顯著低于病毒對照組(其中IFN-α:1μg/m L組低于病毒對照組1.7512倍,P0.05;10μg/m L組低于病毒對照組2.2531倍,P0.05;IFN-β:1μg/m L組低于病毒對照組3.7380倍,P0.01;10μg/m L組低于病毒對照組4.7230倍,P0.01);IL-1β相對表達量均顯著上調(diào),1μg/m L組高于病毒對照組5.6929倍,P0.001;10μg/m L組高于病毒對照組3.9384倍,P0.001;TNF-α的相對表達量有下調(diào)趨勢,僅1μg/m L r Ab-34K2蛋白組與病毒對照組具有統(tǒng)計學(xué)差異(低于病毒對照組1.8294倍,P0.05);IL-10的相對表達量有上調(diào)趨勢,與病毒對照組無統(tǒng)計學(xué)差異;細胞凋亡檢測結(jié)果顯示r Ab-34K2(1μg/m L、10μg/m L)處理后各組間凋亡率變化無統(tǒng)計學(xué)差異,但感染DENV2(MOI=1)24h后r Ab-34K2蛋白組較DENV2對照組細胞凋亡率顯著增多(1μg/m L組凋亡率為(9.1767±2.6303)%,較對照組高2.1989倍,P0.05;10μg/m L組凋亡率為(10.6633±2.8243)%,較對照組高2.5551倍,P0.05)。結(jié)論:成功純化獲得白紋伊蚊唾液34K2原核重組蛋白,該重組蛋白可促進DENV2在Haca T細胞中增殖、CPE和引發(fā)細胞凋亡;r Ab-34K2蛋白可促進感染細胞表達IL-1β并調(diào)控IFN-α/β的產(chǎn)生。該實驗結(jié)果為深入探討白紋伊蚊唾液34K2蛋白在DENV2感染中的生物學(xué)功能提供了一定的實驗證據(jù)。
[Abstract]:Objective: to obtain purified Aedes albopictus (Guangzhou strain) salivary 34K2 recombinant protein in vitro to investigate the formation of cells in DENV2 infected human keratinocytes (Haca T) in the possible biological function. Methods: IPTG P ET-28-34K2/BL21 (DE3) induced by recombinant bacteria, analysis of recombinant protein expression and molecular weight of 12%SDS-PAGE electrophoresis, purification the recombinant protein 34K2 affinity chromatography column (R Ab-34K2) Ni (Western blotting), Western blotting identified the specificity of recombinant protein; cell marker dynamic analysis method (RTCA) real-time monitoring of R Ab-34K2 protein (1 g/m L, 5 g/m L, 10 g/m L) effect on growth of Haca T cells and the DENV2 (MOI=1) Haca infection T cells trigger cytopathic effect (CPE); Ab-34K2 Q RT-PCR real-time detection of R protein (1 g/m L, 10 g/m L) to DENV2 (MOI=1/0.1) Haca infected T cells after viral nucleic acid, IFN- alpha / beta beta alpha, IL-1, TNF-, m the RNA and IL-10. 鍙樺寲;嫻佸紡緇嗚優(yōu)鏈，

本文編號：1771871