本文選題：細粒棘球絳蟲 + 抗原表位　； 參考：《青海大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:1.運用生物信息學的方法對細粒棘球蚴延伸因子-1和磷酸丙糖異構酶T、B細胞表位以及各級結(jié)構進行預測,獲得可取的抗原表位,對兩者的免疫診斷性初步分析,了解其診斷價值。2.利用原核表達技術,通過對上述兩種基因構建表達載體,獲得重組蛋白,為后期免疫保護和診斷價值等研究奠定基礎。方法:1.經(jīng)Expasy系統(tǒng)預測兩種基因的理化性質(zhì),使用DNAStar軟件來分析蛋白親水性、柔性區(qū)域、抗原指數(shù)及表面可及性,利用ABCpred與IEDB軟件綜合預測B細胞線性抗原表位,通過DNAStar軟件預測T細胞表位,使用SOPMA軟件預測二級結(jié)構,SWISS-MODEL網(wǎng)站構建三維結(jié)構。使用DNAstar軟件對Eg和人類EF-1、TPI的氨基酸序列進行比對。2.通過RT-PCR獲得目的基因與克隆載體連接形成重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒與p ET-28α(+)經(jīng)雙酶切連接成原核表達重組質(zhì)粒,表達、純化目的蛋白。用ELISA方法分別對37例囊型包蟲、29例泡型包蟲患者、16例正常人的血清檢出率測定,了解其診斷價值。結(jié)果:1.EgEF-1親水性得分較高的區(qū)域有7個;6個柔性區(qū)域;抗原性指數(shù)得分較高的區(qū)域分布與柔性區(qū)域一致;表面可及性得分較高的區(qū)域較少;可能的B細胞線性表位區(qū)域是:120-130、286-295、306-320、365-378;可能的優(yōu)勢性T細胞表位區(qū)域是:34-48、164-177、222-244、280-290、321-330、396-407;Eg EF-1的二級結(jié)構中α螺旋占32.81%、β折疊22.54%、β轉(zhuǎn)角10.94%、無規(guī)則卷曲33.71%;序列比對,Eg EF-1與人類EF-1的一致性為35.06%,Eg TPI與人類TPI的一致性為8%。Eg TPI親水性得分較高的區(qū)域有8個;8個柔性區(qū)域;抗原性指數(shù)得分較高的區(qū)域分布與柔性區(qū)域大部分一致;表面可及性得分較高的區(qū)域分布區(qū)域相對較少;可能的B細胞線性表位的氨基酸序列為:28-39、50-60、70-80、131-139、150-159、213-231。Eg TPI二級結(jié)構中α螺旋占36%、β折疊22.00%、β轉(zhuǎn)角12.00%、無規(guī)則卷曲30.00%;可能的優(yōu)勢性T細胞表位區(qū)域為:16-30、71-85、98-119、142-154、178-200。2.成功構建重組表達載體,誘導純化出重組蛋白Eg EF-1的分子量在34KD左右,Eg TPI的分子量在27KD左右。ELISA結(jié)果顯示,Eg EF-1血清檢測陽性率為0,但OD值普遍較高,Eg TPI細粒棘球蚴病患者陽性檢出率為86.48%,多房棘球蚴患者陽性檢出率為72.41%,與健康人群比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),但CE和AE間差異沒有顯著性。結(jié)論:1.通過對抗原表位的預測,Eg EF-1有4個B細胞表位的區(qū)域、6個優(yōu)勢性T細胞表位區(qū)域,Eg TPI有6個可能形成B細胞表位的區(qū)域、5個優(yōu)勢性T細胞表位區(qū)域,這些抗原表位預示可作為免疫診斷和藥物治療靶點2.成功純化重組蛋白后,Eg EF-1對兩種病人血清檢測結(jié)果無陽性例數(shù);Eg TPI檢測結(jié)果表明,細粒患者與多房患者之間存在交叉反應,Eg TPI重組蛋白無種屬特異性。
[Abstract]:Purpose 1.Bioinformatics method was used to predict the epitopes and structures of Echinococcus granulosus extension factor 1 (Echinococcus granulosus) and phosphoropropyleneisomerase (TG) B cell epitopes and to obtain the desired epitopes. The immunological diagnostics of Echinococcus granulosus were preliminarily analyzed to find out the diagnostic value of the epitopes. 2.By using prokaryotic expression technique, the recombinant protein was obtained by constructing the expression vector of the above two genes, which laid the foundation for the later study of immune protection and diagnostic value.Method 1: 1.The physicochemical properties of the two genes were predicted by Expasy system. The hydrophilicity, flexibility, antigen index and surface accessibility of the two genes were analyzed by DNAStar software. The linear antigen epitopes of B cells were predicted by ABCpred and IEDB software.Using DNAStar software to predict T cell epitopes and SOPMA software to predict secondary structure SWISS-MODEL website to construct 3D structure.The amino acid sequences of EG and human EF-1TPI were compared by DNAstar software.The target gene was ligated with the clone vector to form a recombinant plasmid by RT-PCR. The recombinant plasmid and p ET-28 偽 () were ligated into prokaryotic expression plasmid by double enzyme digestion, and the target protein was expressed and purified.The detection rate of serum in 37 patients with cystic hydatid cyst and 29 patients with vesicular hydatid disease was determined by ELISA method.Results: 1. There were 7 regions with higher score of hydrophilicity in EgEF-1, 6 flexible regions, the distribution of regions with higher antigenicity index was consistent with that of flexible regions, and less areas with higher surface accessibility score.The possible B cell linear epitope region is: 1: 120-130286-295306-320365-378; the possible dominant T cell epitope region is the secondary structure of the cell EF-1 of: 34-48164-177222-244280-29030-330396-4070.The 偽 helix is 32.81, 尾 folding 22.54, 尾 rotation 10.94, irregular curl 33.71; sequence alignment is 35.06g TPI;There are 8 regions with higher hydrophilicity score of 8%.Eg TPI, 8 flexible regions and 8 flexible regions, which are consistent with human TPI.The regional distribution of higher antigenicity index is consistent with that of flexible region, and the area with higher surface accessibility score is relatively small.The amino acid sequence of the possible B cell linear epitope is as follows: 1. The amino acid sequence of the B cell linear epitope is:: 28-39-139150-159213-231Eg TPI secondary structure: a helix is 36x, 尾 folding 22.00m, 尾 rotation 12.00, irregular curl 30.000.The possible dominant T cell epitope region is: B16-3071-85n98-119142-154178-200.2.The recombinant expression vector was successfully constructed.The result of Elisa showed that the positive rate of Eg EF-1 in serum was 0, but the OD value was generally higher. The positive rate of Eg TPI in patients with echinococcosis was 86.48.The positive rate of echinococcosis was 72.41%, which was compared with the healthy population.The difference was statistically significant (P 0.05), but there was no significant difference between CE and AE.Conclusion 1.The antigenic epitopes of Eg EF-1 were predicted to have 4 B cell epitopes, 6 dominant T cell epitope regions and 6 predominance T cell epitope regions to form B cell epitopes and 5 dominant T cell epitopes.These epitopes indicate that they can be used as targets for immunological diagnosis and drug therapy.After the recombinant protein was purified successfully, there were no positive cases of Eg TPI in serum of the two patients. The results showed that there was cross-reaction between granulated patients and multilocular patients, and there was no species-specificity of the recombinant protein Eg TPI.
【學位授予單位】：青海大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1770338