發(fā)布時(shí)間：2018-04-18 22:13

  本文選題：HIV-1 + 表位　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染已造成世界范圍內(nèi)數(shù)千萬人致病甚至死亡,嚴(yán)重威脅著人類健康。發(fā)展能預(yù)防和阻斷HIV-1感染的疫苗一直是HIV-1研究的核心科學(xué)問題。然而,HIV-1極易發(fā)生突變并可通過多種方式逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng);同時(shí),HIV-1亞型眾多,不同地域的人群感染的HIV-1亞型具有不同的流行特點(diǎn),不同人種的HLA限制性也相差甚遠(yuǎn),這些因素都使得HIV-1疫苗的研發(fā)困難重重。迄今為止,國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量HIV-1疫苗相關(guān)研究并取得一定的進(jìn)展,但仍未研發(fā)出一種安全、有效的疫苗。因此,仍然需要采取不同的發(fā)展策略進(jìn)行HIV-1疫苗的深入研究。本研究針對(duì)中國大陸地區(qū)病毒亞型的流行特點(diǎn)以及中國人群HLA限制性特征,開展以表位為基礎(chǔ)的疫苗設(shè)計(jì)研究,著眼于設(shè)計(jì)發(fā)展一種中國人群適用的HIV-1候選疫苗。本研究擬通過生物信息分析技術(shù),篩選在HIV-1中國主要流行病毒株中序列高度保守而且符合中國人群優(yōu)勢(shì)MHC限制性的表位;進(jìn)行多表位疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)和構(gòu)建;利用多個(gè)不同品系的小鼠模型進(jìn)行疫苗免疫效果評(píng)價(jià);并結(jié)合HIV-1臨床感染者的細(xì)胞標(biāo)本評(píng)價(jià)HIV-1多表位疫苗的人群適用性及在HIV-1預(yù)防和治療方面的應(yīng)用潛力。1.具有中國人MHC限制性特征的HIV-1表位篩選及多表位疫苗設(shè)計(jì)(1)候選表位的篩選及鑒定:為了篩選獲得理想的表位用于疫苗設(shè)計(jì),通過文獻(xiàn)調(diào)研及數(shù)據(jù)庫分析,篩選符合下列要求的表位:1)、表位位于env、gag及pol基因編碼的蛋白上;2)、表位在中國主要流行株(China B、CRF01_AE、CRF07_BC及CRF08_BC)中高度保守;3)、表位的MHC限制性與中國人群優(yōu)勢(shì)分布的HLA基因型一致。利用軟件分析表位的MHC限制性及序列保守性,最終獲得9個(gè)符合條件的CTL表位,分別位于Gag(6個(gè))、Env(2個(gè))及Pol(1個(gè))蛋白上,并選取了一段位于Env蛋白上的由36個(gè)氨基酸組成的Th表位富集區(qū)。(2)多表位核酸疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)、構(gòu)建及鑒定:為了獲得多表位疫苗的最優(yōu)化設(shè)計(jì),以上述篩選獲得的九個(gè)CTL表位及一段Th表位富集區(qū)為基礎(chǔ),通過調(diào)整表位的串聯(lián)順序和呈現(xiàn)方式以及選用不同類型的表位間連接子,嘗試多種多表位設(shè)計(jì)組合,并選擇3個(gè)具有代表性的疫苗設(shè)計(jì)組合(MEG1、MEG2、MEG3),構(gòu)建相應(yīng)的真核表達(dá)質(zhì)粒。通過生物軟件分析三種設(shè)計(jì)的序列結(jié)構(gòu)特征,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)三種質(zhì)粒的體外表達(dá)能力,通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)三種質(zhì)粒的體內(nèi)免疫原性。結(jié)果表明,p JW4303-MEG1與p JW4303-MEG2序列特征相似,均在體外正常表達(dá)并在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng);而p JW4303-MEG3不但其預(yù)測(cè)分析的結(jié)構(gòu)特征與前兩者顯著不同,而且體外轉(zhuǎn)染結(jié)果及體內(nèi)免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。上述結(jié)果說明連接子的種類是多表位疫苗設(shè)計(jì)的主要影響因素之一,以柔性連接子“GGGS”的效果更優(yōu)。(3)多表位核酸疫苗p JW4303-MEG1的免疫原性分析及保護(hù)效果評(píng)價(jià):為了評(píng)價(jià)核酸疫苗p JW4303-MEG1的免疫效果,以BALB/c小鼠為對(duì)象進(jìn)行核酸免疫,評(píng)價(jià)該候選疫苗誘導(dǎo)的單肽特異性免疫反應(yīng)及免疫記憶。結(jié)果表明該質(zhì)粒能有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)所有H-2d限制性表位的單肽免疫反應(yīng),誘導(dǎo)的長期免疫記憶能維持至少一年。進(jìn)一步以重組病毒r TTV-lucgag進(jìn)行小鼠攻毒,通過檢測(cè)小鼠體內(nèi)病毒嗜性組織的熒光素酶活性強(qiáng)度評(píng)價(jià)p JW4303-MEG1的免疫保護(hù)效果,結(jié)果表明免疫組小鼠體內(nèi)的病毒含量與對(duì)照組相比雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但病毒含量有明顯的下降趨勢(shì)。上述結(jié)果說明MEG1多表位疫苗設(shè)計(jì)策略為優(yōu)化的疫苗設(shè)計(jì)方案,對(duì)應(yīng)的核酸疫苗p JW4303-MEG1具有良好的免疫原性。2.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1在BALB/c小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)評(píng)價(jià)(1)多表位蛋白疫苗MEP1的制備及鑒定:為了制備獲得高純度的多表位候選蛋白疫苗MEP1,首先將大腸桿菌密碼子優(yōu)化的多表位序列插入到原核表達(dá)載體p QE30上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p E30-MEG1并酶切鑒定;小量誘導(dǎo)摸索最適誘導(dǎo)條件并鑒定,目的蛋白MEP1主要以包涵體形式表達(dá);大量誘導(dǎo)制備獲得含有MEP1蛋白的包涵體,8M脲溶解后利用Ni+柱親和層析法純化并進(jìn)一步復(fù)性濃縮;利用SDS-PAGE及WB檢測(cè)蛋白的純度及特異性,最終成功制備高純度的目的蛋白MEP1,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)蛋白MEP1在BALB/c雌性小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)特征評(píng)價(jià):為了評(píng)價(jià)重組蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平和免疫保護(hù)效果,以BALB/c雌性小鼠為對(duì)象,三次免疫后檢測(cè)免疫反應(yīng)并開展攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。ELISA結(jié)果表明MEP1能誘導(dǎo)高水平的特異性抗體;ELISPOT結(jié)果表明MEP1與鋁鹽佐劑聯(lián)合免疫能有效誘導(dǎo)Th1/Th2平衡的細(xì)胞免疫應(yīng)答及單肽特異性免疫反應(yīng);攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有一定的保護(hù)效果,能有效降低小鼠卵巢中的模式病毒r TTV-lucgag的含量。另外,該重組蛋白可快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,小鼠單次免疫后10天即可產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。(3)小鼠性別對(duì)重組蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的影響分析:為了評(píng)價(jià)性別因素對(duì)蛋白MEP1誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的影響。以BALB/c雄性小鼠為對(duì)象,進(jìn)行蛋白免疫并進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,蛋白MEP1在雄性小鼠體內(nèi)也能有效誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生。與雌性小鼠的免疫應(yīng)答水平相比,雄性小鼠產(chǎn)生的抗體滴度和Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平略低,Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平則與雌性小鼠相當(dāng)。蛋白在雄性小鼠體內(nèi)同樣具有抗病毒r TTV-lucgag效果,說明重組蛋白MEP1對(duì)不同性別的小鼠均可誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答。3.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1誘導(dǎo)的人MHC限制性免疫反應(yīng)特征研究(1)蛋白MEP1在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答特征研究:為了驗(yàn)證蛋白MEP1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答與表位MHC限制性之間的相關(guān)性,以A2/DR1及A11/DR1轉(zhuǎn)基因小鼠為對(duì)象并以基因本底C57BL/6小鼠為對(duì)照,蛋白聯(lián)合鋁鹽佐劑免疫三次后進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。ELISPOT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果均表明蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答與MHC限制性有顯著關(guān)聯(lián),轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)度及單肽特異性反應(yīng)廣度均顯著優(yōu)于C57BL/6對(duì)照小鼠。進(jìn)一步以A2/DR1小鼠為對(duì)象檢測(cè)蛋白免疫對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的影響,流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明重組蛋白能改變機(jī)體的免疫細(xì)胞構(gòu)成比并上調(diào)APC細(xì)胞表面的MHC-II類分子的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞免疫反應(yīng)。(2)蛋白MEP1對(duì)HIV-1感染者PBMCs的體外刺激效果評(píng)價(jià):為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白MEP1誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與MHC限制性的相關(guān)性,并探索該蛋白在中國人群中的適用性,以HIV-1確診感染者的PBMCs樣本為對(duì)象,進(jìn)行蛋白MEP1體外刺激。ELISPOT結(jié)果顯示HIV-1感染者的PBMCs在蛋白刺激后能顯著分泌細(xì)胞因子IFN-γ及IL-2,而正常人的PBMCs在蛋白刺激后則表現(xiàn)為陰性反應(yīng)。后續(xù)分析結(jié)果表明,重組蛋白MEP1作用于不同MHC限制性人群和不同治療階段的病人,均能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫,預(yù)示該多表位蛋白疫苗在中國人群中適應(yīng)性好。4.結(jié)論本研究篩選獲得了符合中國人群優(yōu)勢(shì)MHC限制性并在HIV-1中國主要流行株中高度保守的9個(gè)CTL表位和一段Th表位富集區(qū)。以此為基礎(chǔ)開展HIV-1多表位候選疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),表位間連接子是多表位疫苗設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵影響因素之一。本研究設(shè)計(jì)和發(fā)展了一種HIV-1候選多表位蛋白疫苗MEP1,該蛋白在小鼠模型中表現(xiàn)出良好的免疫原性和免疫保護(hù)性,并且能有效刺激HIV-1感染者的PBMCs產(chǎn)生免疫反應(yīng)。該蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與MHC限制性密切相關(guān)并且在中國人群中適用性好。本研究不僅為研發(fā)安全有效的HIV-1疫苗提供了新思路,同時(shí)也建立了一套系統(tǒng)的表位疫苗設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)體系,為其他病原疫苗設(shè)計(jì)提供了參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1770302