本文選題：NK92細胞 + K562細胞��； 參考：《安徽醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)細胞是一種是機體重要的免疫細胞,其增殖、成熟和存活等生物學特性受細胞內外復雜的信號調控。細胞信號分子的調控除了受磷酸化等調控外,蛋白水平的翻譯后修飾也非常重要。小類泛素化修飾(small ubiquitin-like modifier,SUMO)蛋白化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾方式,影響細胞轉錄因子的活性和細胞信號的傳導。SUMO特異性蛋白酶1(SUMO-specific proteinase 1,SENP1)是一個調控蛋白SUMO化的重要蛋白酶,能夠促進SUMO的成熟和將SUMO分子與蛋白解離,通過調控細胞信號蛋白穩(wěn)態(tài)而影響細胞的增殖、分化和周期。已知SENP1調控低氧誘導因子HIF等影響紅系造血細胞的生成,但其對NK細胞生物學特性影響并不清楚。白細胞介素21(IL-21)是近年來新發(fā)現的一種細胞因子,主要由激活的CD4+細胞產生。NK細胞IL-21R在靜息和激活狀態(tài)下的NK細胞都有表達,IL-21對NK細胞的增殖和功能起到調節(jié)作用。但SENP1是否參與IL-21的信號轉導及調控NK細胞的生物學特性作用有待闡明。本文從IL-21對NK細胞SENP1的表達調控及其對增殖、存活和殺傷活性等方面進行了闡述。研究目的:(1)觀察IL-21對NK92細胞表達SENP1的誘導作用(2)檢測干涉SENP1對NK92細胞凋亡、增殖的影響(3)探究干涉SENP1對NK92細胞殺傷活性的影響。研究方法:(1)在缺乏IL-2的培養(yǎng)體系中加入IL-21刺激NK92細胞,用CCK8試劑盒檢測不同時間點細胞的增殖情況;用利用Annexin V-APC/PI標記檢測細胞的凋亡;并使用qRT-PCR、免疫印跡的方法檢測SENP1在NK92細胞中的表達情況。(2)使用攜帶Senp1-shRNA的慢病毒感染NK92細胞后,使用流式細胞儀以及熒光顯微鏡檢測感染效率,并同時使用qRT-PCR、免疫印跡的方法確認干涉效率。(3)以感染對照病毒的NK92細胞為參照,使用慢病毒shRNA干涉Senp1后利用CCK8試劑盒檢測不同時間點NK92細胞系的增殖情況,利用Annexin V-APC/PI標記細胞,流式細胞術檢測干涉Senp1后NK92細胞凋亡。(4)使用慢病毒shRNA干涉Senp1后用qRT-PCR方法檢測殺傷因子的表達。(5)將帶熒光素酶標記的K562細胞與NK92細胞共培養(yǎng),用熒光素酶報告基因的方法檢測NK92細胞的殺傷活性。研究結果:(1)IL-21刺激能夠明顯上調NK92細胞表達SENP1,并且IL-21上調NK92細胞表達SENP1具有量效關系。(2)IL-21抑制NK92細胞的凋亡,能夠減緩乏IL-2導致的NK92細胞死亡的數目,且與IL-21的濃度具有相關性。(3)與感染對照病毒NK92細胞比較發(fā)現,在感染慢病毒shRNA后,NK92細胞Senp1在mRNA表達降低,差異具有統(tǒng)計學意義;在蛋白水平中,SENP1的表達也受到了明顯的抑制。(4)慢病毒感染細胞凋亡24h,Senp1干涉組細胞凋亡率與對照組比較,干涉Senp1可以促進NK92細胞凋亡。(5)使用CCK8方法檢測細胞的增殖變化后發(fā)現干涉Senp1后可以顯著抑制NK92細胞增殖,差異具有統(tǒng)計學差異。(6)與病毒感染對照組比較,Senp1干涉組NK92細胞對K562細胞的殺傷活性增強,顆粒酶B、IFN-γ表達降低,穿孔素的表達顯著升高。結論:IL21能夠提高NK92細胞表達SENP1,抑制NK92細胞的凋亡,減少乏IL-2導致的NK92死亡的數目。干涉Senp1不僅促進NK92細胞凋亡,還能抑制增殖,同時影響穿孔素表達和對腫瘤細胞的殺傷活性。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1761247